殼聚糖對黃瓜穴盤苗根際細菌多樣性的影響

中國農業(yè)大學學報，（）殼聚糖對黃瓜穴盤苗根際細菌多樣性的影響董春娟李亮張志剛王玲玲尚慶茂（中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所農業(yè)部園藝作物生物學與種質創(chuàng)制重點實驗室環(huán)渤海灣地區(qū)設施蔬菜優(yōu)質高效生產協同創(chuàng)新中心，北京）摘要為明確殼聚糖對黃瓜穴盤苗根際細菌群落結構的影響，以添加殼聚糖的草炭、蛭石、珍珠巖為基質，進行黃瓜穴盤育苗試驗，測定幼苗生長指標，并采用焦磷酸測序技術測定穴盤苗根際細菌的種群變化。結果表明基質添加殼聚糖可以顯著促進黃瓜穴盤苗生長。添加殼聚糖使穴盤苗根際基質中細菌群落的、和指數減小，指數增大，根際細菌群落的豐富度和多樣性降低。序列分析表明，黃瓜穴盤苗根際基質中的細菌主要是叢毛單胞菌科屬、假單胞菌科纖維弧菌屬、黃色桿菌科屬和草酸桿菌科屬等。添加殼聚糖后，根際細菌如屬、纖維弧菌屬、根瘤菌屬、屬、屬等的相對豐度顯著升高，這些細菌屬多具有植物促生潛力；而食酸菌屬、屬、屬、豐祐菌屬、纖維單胞菌屬等的相對豐度顯著降低?？梢姡|添加殼聚糖有利于根際有益細菌的選擇性富集，改善黃瓜穴盤苗根際微生態(tài)環(huán)境，促進幼苗生長。關鍵詞黃瓜；殼聚糖；基質；根際細菌；測序中圖分類號文章編號（）文獻標志碼收稿日期基金項目國家自然科學基金項目（）；公益性行業(yè)（農業(yè)）科研專項經費項目（）；現代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項資金（）；中國農業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程（）第一作者董春娟，副研究員，主要從事蔬菜種苗發(fā)育調控研究，通訊作者尚慶茂，研究員，主要從事蔬菜種苗發(fā)育調控及繁育技術研究，（，），（，），；第期董春娟等殼聚糖對黃瓜穴盤苗根際細菌多樣性的影響殼聚糖（，）是甲殼素脫乙酰基的產物，因其來源廣泛、無毒無害、無殘留，以及同生物體極好的兼容性，常被用作植物病害抑制劑、種衣劑、植物生長調節(jié)劑、農藥載體等，在農業(yè)上廣泛應用，。葉面噴施殼聚糖可以顯著促進黃瓜、番茄等植株對營養(yǎng)物質的吸收，提高植株光合能力，促進根系細胞分生，促進植物生長。作為土壤改良劑，殼聚糖可被土壤中微生物分解，活化土壤的和養(yǎng)分，且殼聚糖分子對土壤中微量元素、和等具有螯合效應，可以提高土壤中微量元素的有效態(tài)養(yǎng)分。然而，施用殼聚糖是否對植物根際微生態(tài)環(huán)境有所影響，尚未見報道。植物根際細菌多樣性與植物生長發(fā)育密切相關。一方面，根際有益細菌可以直接參與土壤營養(yǎng)元素的代謝循環(huán)，促進有機質分解，提高養(yǎng)分的有效性，或分泌多種促生長類激素直接促進植物生長，同時根際有益細菌還可以通過競爭營養(yǎng)或侵染位點，合成抗生素類物質或載鐵蛋白等機制抑制根際病原細菌的繁殖，協助植物抵御病害，提高植物免疫力。另一方面，根際有害細菌通過分泌毒素、競爭營養(yǎng)物質等抑制植物生長，尤其是一些病原細菌，通過侵染植物的維管束，造成植物水分、養(yǎng)分運輸中斷，引起植物枯萎、根腐和猝倒等癥狀。多數根際細菌難以在實驗室條件下培養(yǎng)。二代測序技術的興起，包括焦磷酸測序、等平臺為根際細菌探索提供了很好的途徑，可以更加高效、準確地反映根際細菌的多樣性信息。黃瓜（）種植以育苗移栽為主，且主要采用穴盤育苗方式。基質是穴盤育苗的重要組成部分，由于基質配制不科學、操作不規(guī)范等，常造成幼苗根際基質的微生態(tài)環(huán)境不良，苗期病害時有發(fā)生。添加生物活性物質改善基質的生物學特性，為幼苗提供良好的根際環(huán)境，對于黃瓜壯苗培育至關重要。本研究采用焦磷酸高通量測序技術分析了基質添加殼聚糖對黃瓜穴盤苗根際細菌群落結構的影響，旨在從細菌多樣性角度豐富殼聚糖的促生機制，為黃瓜穴盤苗根際調控和壯苗培育提供理論依據。材料與方法黃瓜穴盤苗培養(yǎng)供試黃瓜選用“中農號”（），由中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所選育。黃瓜種子經體積分數為的溶液表面消毒，無菌水沖洗遍后，恒溫培養(yǎng)箱中催芽。種子萌發(fā)后，選擇發(fā)芽一致的種子播種于裝有草炭蛭石珍珠巖（體積比為）混合基質的孔穴盤中，每穴孔一粒種子。草炭購自北京大漢園景有限公司（，德國），草炭，值；蛭石和珍珠巖購自河北靈壽縣騰達礦產品加工廠，粒徑分別為和?；|中添加殼聚糖（，脫乙酰度，國藥集團化學試劑有限公司），以不加殼聚糖的基質作為對照（）。播種后覆蓋厚的蛭石，并充分澆水，直至穴盤底部排水孔有水滴出現。育苗試驗于年月在中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所玻璃溫室中進行，平均晝夜溫度分別為（）（），自然光照強度（約（）和光周期，平均相對濕度。待黃瓜幼苗子葉平展后，每隔使用“花多多”水溶速效復合肥（，）溶液進行追肥，施肥氮（）濃度為，至第一真葉展開后每隔施用“花多多”水溶肥，施用量為穴盤，施肥與灌水交替進行。每個處理設次重復，每重復個穴盤。黃瓜幼苗生長指標測定播種后，每處理每重復隨機選取株幼苗，測定株高、莖粗、葉面積、地上部鮮重、根鮮重和根體積等生長指標，測定方法參照高曉旭等。根際基質細菌多樣性分析根際基質樣品收集與基因組提取播種后，每處理每重復隨機選取株黃瓜幼苗，根際基質的收集參照聶艷麗等的方法，抖落根區(qū)基質后，用小刷子將根系緊密附著的基質輕輕掃下，收集、混勻，過篩，去除較大的基質塊和植物根系組織，將所得基質裝入無菌自封袋中，冰箱保存，用于細菌基因組提取。使用公司試劑盒抽提基質基因組，采用大量產物純化試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）進行純化。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組，并采用（，）測定濃度。擴增與焦磷酸測序以純化后的基因組為模板，采用細菌通中國農業(yè)大學學報年第卷用引物對的區(qū)進行擴增，引物序列分別為（）和（），由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司合成。同時在引物的端添加序列區(qū)分樣品。反應體系包括聚合酶（全式金生物技術有限公司，北京）、緩沖液、正向引物（）、反向引物（）、模板，補至。反應程序為預變性，變性，退火，延伸，個循環(huán)后，延伸，保持直到反應完成。反應在型儀（，）中進行。每個樣品個重復，將同一樣品的產物混合后用瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用凝膠回收試劑盒（，）切膠回收產物，洗脫。瓊脂糖凝膠電泳再次檢測、定量。參照電泳初步定量結果，將產物用藍色熒光定量系統(tǒng)（，）進行檢測定量，將各擴增產物等量（）混合，用于測序。測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司使用（，）完成，試劑采用。測序讀長為。序列數據分析通過區(qū)分各樣品的測序數據，并生成不含的各樣品測序的有效序列文件。然后對有效序列進行去雜優(yōu)化，包括保留引物的錯配數在個以內的序列；使用軟件（）檢測接頭和修剪末端，去除序列末端的后引物的接頭序列、多堿基、尾巴及低質量堿基；使用軟件（）去除長度短于，模糊堿基數、序列平均質量的序列。采用軟件進行（可操作分類單元，）聚類分析，主要步驟包括合并序列長度和堿基組成完全一致的序列，提取非重復序列；采用的方法（），與數據庫（版）中的核糖體序列數據庫（、）進行比對；使用（）檢測并去除序列；計算比對對齊后的序列間非校正配對距離，使用方法（）按相似度聚類生成。使用稀釋曲線（）和曲線表征樣品的測序深度，采用程序得出指數和指數表示物種的豐富度，以指數和指數評估樣品的物種多樣性。為了獲得每個的分類學信息，將相似水平下每個中的所有序列進行一致性分析，找出同一個中的不同序列的最近祖先的種屬信息作為該的種屬信息。所用軟件為分類學分析（），算法為。數據統(tǒng)計分析試驗結果用次重復的平均值標準差（）表示，采用檢驗進行差異顯著性分析。結果與分析殼聚糖對黃瓜穴盤苗生長發(fā)育的影響基質添加殼聚糖對黃瓜幼苗出苗率及出苗速率沒有顯著影響。但播種后時幼苗株高、地上部鮮重以及第二真葉面積等參數顯著高于對照（表），可見，基質添加殼聚糖可以促進黃瓜穴盤苗的生長。焦磷酸測序數據的統(tǒng)計分析采用焦磷酸測序法分析不同基質樣品的細菌多樣性，如表所示，共獲得條有效序列，序列平均長度為，按照質量控制原則對有效序列進行篩選，篩選后的優(yōu)化序列共條，優(yōu)化序列平均長度為，每個樣品得到的優(yōu)化序列數量為條。經比對，共有條序列可以比對到數據庫中，占優(yōu)質序列的。在相似度水平，共獲得個，對照樣品中數量分別為、和條，添加殼聚糖的基質中數量略低，分別為、和條。第期董春娟等殼聚糖對黃瓜穴盤苗根際細菌多樣性的影響表殼聚糖對黃瓜穴盤苗生長發(fā)育的影響樣品株高莖粗地上部鮮重第一真葉面積第二真葉面積根鮮重根體積殼聚糖注，表示在和水平與對照相比差異顯著。下同。表黃瓜穴盤苗各根際基質樣品測序數據量統(tǒng)計樣品有效序列優(yōu)化序列匹配的序列數量（）（）（）（）（）（）（）（）殼聚糖（）（）（）（）總計注括號內數字表示優(yōu)化序列占有效序列的百分比；括號內數字表示匹配的序列占優(yōu)化序列的百分比；聚類的相似度水平為。；稀釋曲線可以反映樣品的測序深度，如圖所示，在的相似度水平下，不同根際基質樣品的稀釋曲線趨于平坦，但均未達到飽和，說明測序數據量合理，更多的數據量只會產生少量新的，該測序深度能基本完整反映細菌群落多樣性。曲線利用各樣品的測序量在不同測序深度時的指數構建曲線，當曲線趨于平坦時，說明測序數據量足夠大，可以反映樣品中絕大多數的微生物信息。由圖可知，所有樣品的指數均達到平臺期，進一步說明所有樣品的測序深度均能反映根際細菌多樣性信息。添加殼聚糖對黃瓜穴盤苗根際細菌多樣性的影響將各樣品測序獲得的優(yōu)質序列用于評價基質細菌多樣性，如表所示。和指數用于估圖不同根際基質樣品的稀釋曲線和曲線（相似水平）（）中國農業(yè)大學學報年第卷計樣品中物種總數，可以反映樣品的物種豐富度。添加殼聚糖的基質中和指數顯著降低（），表明基質添加殼聚糖可以降低黃瓜根際基質中細菌的豐富度。和指數反映樣品中微生物多樣性。值越大，表明群落多樣性越高；與之相反，指數值越小，表明群落多樣性越高。如表所示，添加殼聚糖后，指數減小，指數增大，表明根際細菌群落多樣性水平降低?？梢姡|添加殼聚糖可以引起黃瓜穴盤苗根際細菌群落豐富度和多樣性水平降低。表殼聚糖對黃瓜穴盤苗根際基質樣品的細菌多樣性的影響樣品豐富度指數多樣性指數對照殼聚糖基質添加殼聚糖對黃瓜穴盤苗根際細菌群落結構的影響利用序列信息對黃瓜穴盤苗的根際細菌群落組成進行分析。在科分類水平，在對照和添加殼聚糖的根際基質樣品中，分別鑒定到和個科，種樣品中共有的科有個。其中相對豐度大于的已知細菌科有個，如圖所示。對照樣品主要的細菌有叢毛單胞菌科（，）、黃單胞菌科（，）、假單胞菌科（，）、柄桿菌科（，）、草酸桿菌科（，）和紅螺菌科（，）。添加殼聚糖后，根際基質中主要細菌為叢毛單胞菌科（）、假單胞菌科（）、黃單胞菌科（）、柄桿菌科（）、微桿菌科（，）、紅螺菌科（）和根瘤菌科（，）。其中叢毛單胞菌科、假單胞菌科、根瘤菌科、鞘脂單胞菌科、鞘脂桿菌科（）、微單胞菌科（）等的相對豐度顯著升高，而黃單胞菌科、草酸桿菌科、酸桿菌科（）、豐祐菌科（）等的相對豐度顯著降低（圖）。在屬分類水平，所有序列共分為個屬，其中對照根際基質樣品中共鑒定到個屬，添加殼聚糖的基質中較低，只有個屬。相對豐度大于的已知細菌屬共個，如圖所示。對照根際基質樣品中，屬（）、纖維弧括號內數字表示相對豐度，為次重復的平均值。圖殼聚糖對黃瓜穴盤苗根際基質細菌群落的影響（科分類水平）第期董春娟等殼聚糖對黃瓜穴盤苗根際細菌多樣性的影響圖殼聚糖對黃瓜穴盤苗根際基質細菌群落的影響（屬分類水平）菌屬（）、屬（）和屬（）為優(yōu)勢菌屬，其相對豐度均大于。添加殼聚糖后，屬、纖維弧菌屬的相對豐度顯著升高，而屬和屬的相對豐度則顯著降低。此外，屬、根瘤菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、微桿菌屬、屬、屬和屬的相對含量均有顯著升高；而相對豐度顯著降低的細菌菌群有屬、食酸菌屬、豐祐菌屬、纖維單胞菌屬等（圖）。進一步將得到的鑒定到種，但是多數序列無法獲得其菌種信息，圖列出了種發(fā)生顯著差異的已知細菌的相對豐度變化。如圖所示，根瘤菌屬和的相對豐度分別是對照樣品的和倍；此外，屬、微桿菌屬、指孢囊菌屬和中慢生根瘤菌屬的相對豐度也有顯著升高。相比對照，添加殼聚糖的根際基質中屬的相對豐度顯著降低，只有對照的。結論與討論基質添加殼聚糖可以顯著促進黃瓜穴盤苗的生長發(fā)育（表），進一步采用焦磷酸測序技術分析了基質添加殼聚糖對黃瓜穴盤苗根際細菌群落結構的影響，發(fā)現添加殼聚糖后根際基質的和指數顯著降低，指數減小，指數增大（表），表明殼聚糖可以引起根際基質細菌豐富度和群落多樣性顯著降低。分析原因，殼聚糖可以作為一種新的碳源物質，被根際某些細菌分解利用，因此為根際細菌的生長提供了一個選擇性的環(huán)境，利于可以分解和利用殼聚糖的細菌生長，而原有細菌菌群受到競爭性抑制，從而導致根際細菌多樣性降低?；|添加殼聚糖可以改變黃瓜穴盤苗的根際細菌群落組成。基質添加殼聚糖后，穴盤苗根際基質中屬、纖維弧菌屬、根瘤菌屬、屬、屬等的相對豐度顯著升高，而原有優(yōu)勢菌屬屬、屬、食酸菌屬、豐祐菌屬、纖維單胞菌屬等的相對豐度則顯著降低（圖和圖），這與已報道的土壤中添加殼聚糖后植物根際細菌群落的變化趨勢相一致，。進一步分析這些上調菌群的生物學功能，發(fā)現中國農業(yè)大學學報年第卷圖殼聚糖對黃瓜穴盤苗根際基質中種細菌相對豐度的影響屬、纖維弧菌屬、根瘤菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、屬等細菌多為植物促生菌。多數屬細菌基因組中含有糖苷水解酶編碼基因，可以分解基質中的纖維素、半纖維素以及外源添加的殼聚糖等多糖分子，為幼苗生長提供更多的碳源和養(yǎng)分，促進幼苗生長，。添加殼聚糖后纖維弧菌屬的豐度顯著增加，這與之前的報道一致。等發(fā)現在河流、壕溝等不同的生態(tài)環(huán)境中添加甲殼素或殼聚糖后，纖維弧菌屬細菌均顯著增多成為優(yōu)勢菌群。多數纖維弧菌屬細菌可以合成幾丁質酶，分解殼聚糖，甚至一些纖維弧菌，如經甲殼素誘導后會分泌多種多糖水解酶，促進根際糖類物質的分解和活化。此外，部分纖維弧菌屬細菌還具有固氮功能，對植物根部氮素的吸收具有促進作用。另一類顯著升高的根際細菌為根瘤菌屬。黃瓜穴盤苗根際主要的根瘤菌包括和（圖），這兩種細菌廣泛存在于植物根際土壤中，是最主要的植物非共生固氮菌。纖維弧菌和根瘤菌數量的升高有助于植物根部氮的固定和利用，促進植物生長。鞘氨醇單胞菌屬和屬細菌的增多有助于植物抵御根部細菌或真菌性病害。等發(fā)現，根際鞘氨醇單胞菌可以提高萵苣抗根腐病的能力。此外，殼聚糖自身對嗜酸菌屬、黃單胞菌屬等植物致病性細菌也具有一定的抑菌效果，?？梢?，基質添加殼聚糖后，引起黃瓜穴盤苗根際屬、纖維弧菌屬、根瘤菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、屬等具有促生潛力的細菌數量增多，促進植物根部碳、氮等養(yǎng)分的活化和吸收，抵御根際致病性細菌的繁殖和侵染，從而改善黃瓜穴盤苗的根際微生態(tài)環(huán)境，促進幼苗的生長發(fā)育。本研究采用焦磷酸測序技術分析了基質添加殼聚糖對黃瓜穴盤苗根際細菌群落結構的影響，豐富了殼聚糖的促生機制。相較于傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的方法，基于的測序技術在分析量和信息量上具有明顯的優(yōu)勢，但這種方法也有一定的局限性，無法將游離于細胞外的以及死亡細胞的與具有活性的細胞區(qū)分開來，且序列信息的解析基于數據庫，部分序列無法獲得其分類信息。因此，對黃瓜穴盤苗根際促生細菌的分離和功能鑒定，并探究其促進幼苗生長的作用機制，將是下一步開展的工作重點。參考文獻，于仁竹，于賢昌，王桂紅殼聚糖對黃瓜幼苗生長和生理特性的影響西北農業(yè)學報，（），（）（），第期董春娟等殼聚糖對黃瓜穴盤苗根際細菌多樣性的影響，蔣小姝，莫海濤，蘇海佳，張小勇甲殼素及殼聚糖在農業(yè)領域方面的應用中國農學通報，（），（）（），（）康貽軍，程潔，梅麗娟，胡健，樸哲，殷士學植物根際促生菌作用機制研究進展應用生態(tài)學報，（），（），（）（），（）高曉旭，張志剛，段穎，董春娟，尚慶茂高濃度營養(yǎng)液對黃瓜和番茄下胚軸徒長的抑制作用植物營養(yǎng)與肥料學報，（），（）（）聶艷麗，陸斌，劉金鳳，童清不同育苗基質的團花根際微生物群落功能多樣性特征中南林業(yè)科技大學學報，（），（）（），（），