''紅顏''草莓中果糖激酶基因FaFRK3的克隆與表達分析.pdf

收稿日期 2019 01 15 基金項目 上海市農(nóng)業(yè)基礎性研究項目 滬農(nóng)科攻字 2014 第7 2 2號 上海市科委農(nóng)業(yè)科技重點攻關項目 16391901400 作者簡介 呂文遠 1993 女 在讀碩士 主要從事草莓分子遺傳學研究 E mail lvwenyuan1003 126 com 通信作者 E mail kduan936 126 com 上海農(nóng)業(yè)學報 2020 36 6 1 5 http www nyxb sh cn Acta Agriculturae Shanghai DOI 10 15955 j issn1000 3924 2020 06 01 呂文遠 張麗勍 高清華 等 紅顏 草莓中果糖激酶基因FaFRK3的克隆與表達分析 J 上海農(nóng)業(yè)學報 2020 36 6 1 5 紅顏 草莓中果糖激酶基因FaFRK3的克隆與表達分析 呂文遠1 2 張麗勍2 高清華2 段 可2 1上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院 上海201306 2上海市農(nóng)業(yè)科學院林木果樹研究所 上海201403 摘 要 以 紅顏 草莓果實為材料 經(jīng)RNA提取后反轉(zhuǎn)錄獲得草莓果糖激酶基因FaFRK3全長序列 并對 其進行生物信息學分析和表達分析 結(jié)果表明 草莓FaFRK3基因完整讀碼框ORF長1 158 bp 編碼386個氨基 酸 其編碼蛋白的等電點和相對分子質(zhì)量分別為5 04和94 292 57 ku 草莓FaFRK3基因與其他植物的FRK基 因相似度較高 FaFRK3基因編碼蛋白屬于pfkB糖激酶家族 實時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn) FaFRK3基因在 紅顏 草莓不同器官的表達量相差較大 其中在種子中的相對表達量最高 在莖中的相對表達量最低 該基因在不同 發(fā)育時期的相對表達量也存在差異 隨著草莓果實成熟 FaFRK3基因相對表達量逐漸降低 關鍵詞 紅顏 果糖激酶基因 基因克隆 表達分析 中圖分類號 S668 4 文獻標志碼 A 文章編號 1000 3924 2020 06 001 05 Cloning and expression analysis of fructokinase gene FaFRK3 from Benihoppe strawberry L Wenyuan1 2 ZHANG Liqing2 GAO Qinghua2 DUAN Ke2 1 College of Fisheries and Life Sciences Shanghai Ocean University Shanghai 201306 China 2 Forest and Fruit Tree Research Institute Shanghai Academy of Agricultural Sciences Shanghai 201403 China Abstract Using Benihoppe strawberry fruit as material the full length sequence of strawberry fructokinase gene FaFRK3 was obtained by RNA extraction and reverse transcription and its bioinformatics and expression analysis were carried out The results showed that the ORF of FaFRK3 gene was 1 158 bp and encoded 386 amino acids The isoelectric point and relative molecular mass of the protein were 5 04 and 94 292 57 ku respectively The FaFRK3 gene of strawberry was similar to that of other plants The protein encoded by FaFRK3 gene belonged to the pfkB glycokinase family Real time fluorescent quantitative PCR showed that the expression of FaFRK3 gene in different organs of Benihoppe strawberry was quite different The relative expression level of FaFRK3 gene in seed was the highest and that in stem was the lowest The relative expression of FaFRK3 gene also changed in different developmental stages With the ripening of strawberry fruit the relative expression of FaFRK3 gene decreased gradually Key words Benihoppe Fructokinase gene Gene cloning Expression analysis 草莓果實中的可溶性糖主要有3種 蔗糖 葡萄糖 果糖 其中果糖甜度最高 紅顏 草莓果實中果糖含 量相對較高 1 植物光合作用主要產(chǎn)物是蔗糖 蔗糖和尿苷 5 二磷酸二鈉鹽 UDP 在蔗糖合酶 Sucrose Synthase SS EC2 4 1 13 的作用下水解為果糖和尿苷二磷酸葡萄糖 UDPG 該過程是可逆的 2 果糖在 果糖激酶 Fructokinase FRK EC2 7 1 4 的作用下進一步磷酸化生成6 磷酸果糖 己糖激酶 Hexokinase HK EC 2 7 1 1 主要磷酸化葡萄糖 果糖激酶主要磷酸化果糖 3 FRK在果糖代謝過程中具有十分重要的 作用 已知的FRKs是碳水化合物嘌呤激酶家族的成員 被稱為磷酸果糖激酶B pfkB 家族 4 該家族與植 物中的果糖代謝合成途徑密切相關 對FRK基因表達的研究有助于揭示植物中果糖的代謝與合成 呂文遠 等 紅顏 草莓中果糖激酶基因FaFRK3的克隆與表達分析 馬鈴薯 5 鱷梨 6 大麥 7 豌豆 8 9 水稻 10 和柑橘 11 等作物中的FRK基因均已被分離出來 甘蔗 中有7個與果糖激酶相關的基因 ScFRK1 ScFRK7 其中ScFRK1和ScFRK5是主效基因 ScFRK1基因 表達量最高 ScFRK5基因次之 ScFRK4基因在赤霉素的脅迫下表達量明顯上升 12 在擬南芥中 果糖激 酶AtFEK1和AtFRK2基因?qū)蔷哂休^高特異性 13 在日本梨果實中 隨著果糖含量的增加 果糖激酶 的活性會持續(xù)下降 14 Qin等 15 在枇杷中分離出果糖激酶EjFRK基因 通過動態(tài)監(jiān)測EjFRK基因轉(zhuǎn)錄 本和FRK酶活性的變化 發(fā)現(xiàn)EjFRK基因在果實發(fā)育早期的表達水平較高 成熟期表達水平較低 與 FRK酶活性的變化趨勢相似 而FRK酶活性的變化與果實發(fā)育進程方向相反 高FRK酶活性不利于枇杷 果實果糖積累 趙建華等 16 從 寧杞1號 枸杞果實中分離得到LbFRK7基因 發(fā)現(xiàn)該基因在枸杞果實的 發(fā)育過程中對果糖轉(zhuǎn)化具有一定的作用 特別是在果實成熟過程中對果糖含量的升高具有重要作用 Yang等 17 研究發(fā)現(xiàn) 蘋果的莖尖和幼果中 MdFRK2基因的表達非常高 草莓果實糖分積累研究較多 但有關草莓果實甜度控制重要的果糖代謝和果糖激酶基因的研究尚未見報道 本試驗以 紅顏 草莓果 實為材料 克隆和分離獲得草莓果實中FaFRK3基因的cDNA全長序列 并對 紅顏 植株不同器官以及草 莓果實發(fā)育各個時期的FaFRK3基因的表達進行分析 以期為后續(xù)基因功能分析和果實甜度遺傳控制奠 定基礎 1 材料與方法 1 1 植物材料及試劑 選取2017年10月種植于上海市農(nóng)業(yè)科學院莊行試驗站塑料大棚中生長狀況良好的草莓品種 紅 顏 Fragaria ananassa Duchesne Benihoppe 為試驗材料 分別選取綠果期 G 果實綠色 瘦果緊密 聚合 白果期 W 果實白色膨大 瘦果不再緊密聚合 轉(zhuǎn)色期 T 果實著色面積達25 50 成熟期 R 果實完全著色成熟 4個發(fā)育階段的草莓果實 以及 紅顏 植株的根 短縮莖 葉 花 種子5個器官 每個時期的果實設置3次生物學重復 隨機選取同一時期的10個果實混為一組 共3組進行液氮磨樣 存 放于 80 冰箱中備用 所用載體為入門載體pDONR221 大腸桿菌TOP10和根癌農(nóng)桿菌GV3101購于上海唯地生物技術有 限公司 質(zhì)粒小抽試劑盒和DNA純化試劑盒購于天根生化科技有限公司 植物RNA提取試劑盒為E Z N A Plant RNA Kit 美國OMEGA公司 SYBR Green 熒光染料購于上海生工生物工程股份有限公司 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于大連TaKaRa公司 引物由上海生工生物工程股份有限公司合成 1 2 試驗方法 1 2 1 FaFRK3基因全長cDNA的克隆 利用E Z N A Plant RNA試劑盒從 紅顏 草莓果實中提取RNA 利用Oligo軟件進行FaFRK3基因 CDS引物 FaFRK3 F和FaFRK3 R 設計 表1 使用MLV反轉(zhuǎn)錄酶 RNase Inhibitor進行反轉(zhuǎn)錄 得到單 鏈cDNA PCR反應體系為 25 L 2 Es Taq MasterMix Dye 上下游引物各2 L 1 L cDNA 加水至 50 L體系 PCR反應程序 98 預變性5 min 98 變性30 s 62 退火30 s 72 延伸2 min 共30 個循環(huán) 72 延伸5 min 擴增后的PCR產(chǎn)物使用膠回收試劑盒回收得到FaFRK3基因的目的片段 連 接到pDONR221入門載體上 18 重組載體轉(zhuǎn)入TOP10大腸桿菌感受態(tài)細胞中 菌液檢測呈陽性的單克隆 送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序 表1 試驗所用引物 Table 1 Primers used in the experiment 引物名稱序列 5 3 Tm 目的片段長度 bp EF1 F TGGATTTGAGGGTGACAACATGA EF1 R GTATACATCCTGAAGTGGTAGACGGAGG FaFRK3 F ATGGGGAGAAACCGAACCACCCACCTC FaFRK3 R TGGTTTAAGGTCCACTGTTCGAATTG FaFRK3 qRT F GAATGTAGCAGGACATGAAC FaFRK3 qRT R CGAATTGGCTCCTCATAGAC 55 145 62 1 158 55 195 1 2 2 生物信息學分析 通過Pfam分析得到果糖激酶保守結(jié)構(gòu)域pfkB PF00294 24 氨基酸序列 將該序列在GDR https 2 上 海 農(nóng) 業(yè) 學 報 www rosaceae org 中進行BLAST分析 得到草莓中基因序列mrna07897 1 v1 0 hybrid BLAST分析表 明 該基因序列與FRK3基因一致性最高 因此將其命名為FaFRK3 使用MEGA5構(gòu)建Neighbor Joining 系統(tǒng)進化樹 bootstrap重復次數(shù)為1 000次 圖2 利用ProtParam http web expaasy org protparam 對 FaFRK3蛋白進行蛋白質(zhì)性質(zhì)分析 通過DNAMAN進行序列相似性分析 利用HMMER http www hmmer org 對基因序列結(jié)構(gòu)域和功能進行分析 利用ProtScale http web expasy org protscale 對 FaFRK3蛋白進行親疏水性分析 1 2 3 FaFRK3基因表達分析 使用Oligo軟件進行實時熒光定量分析引物 FaFRK3 RT F FaFRK3 RT R 設計 表1 內(nèi)參引物為 EF1 參照呂文遠等 19 定量方法對FaFRK3基因進行實時熒光定量分析 3次生物學重復 采用2 CT 方法進行數(shù)據(jù)處理 2 結(jié)果與分析 2 1 紅顏 草莓FaFRK3基因克隆分析 利用Oligo軟件設計的引物 FaFRK3 F R 進行PCR擴增 獲得目的基因 圖1 FaFRK3基因含有一 個1 158 bp的開放閱讀框 ORF 編碼有386個氨基酸 其編碼蛋白理論等電點和相對分子質(zhì)量分別為 5 04和94 292 57 ku FaFRK3蛋白分子式為C3757H6241N1275O1611S270 脂肪酸系數(shù)為20 47 不穩(wěn)定系數(shù)為 39 46 是一個穩(wěn)定的蛋白 屬于pfkB糖激酶家族 通過DNAMAN進行序列比對顯示 其與FRK蛋白氨 基酸序列相似性較高 其中與月季的FRK蛋白氨基酸序列相似性最高 圖2 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp 1158bp FaFRK3 FaFRK3 CK M 1158bp 注 FaFRK3為目的基因條帶 CK為空白對照 M為Marker 圖1 紅顏 草莓FaFRK3基因PCR擴增電泳 Fig 1 PCR amplification and electrophoresis of Benihoppe strawberry FaFRK3 gene 100 100 100 100 99 99 0 5 草 莓 mrna07897 1 v1 0 hybrid 月 季 XP 024157436 1 水 蜜 桃 XP 007205340 1 棗 XP 015873836 1 番 木 瓜 XP 021909927 1 柑 橘 XP 006425063 1 番 茄 XP 004241162 1 南 瓜 XP 022964857 1 擬 南 芥 AT1G06020 1 獼 猴 桃 PSR86166 1 圖2 植物果糖激酶家族基因系統(tǒng)進化樹 Fig 2 Phylogenetic tree of fructosekinase family gene in plant 2 2 FaFRK3蛋白結(jié)構(gòu)分析 對測序所得基因序列結(jié)構(gòu)域和功能進行分析 利用SignalP工具進行信號肽預測顯示 該基因含有一 個信號肽 位置為1 27堿基 分值為0 450 圖3 利用ProtScale進行親疏水性分析表明 FaFRK3蛋白 大部分氨基酸屬于疏水性氨基酸 圖4 說明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定 2 3 FaFRK3基因定量表達分析 由定量分析結(jié)果可以看出 FaFRK3基因在 紅顏 草莓莖中的相對表達量最低 在種子中的相對表達 3 呂文遠 等 紅顏 草莓中果糖激酶基因FaFRK3的克隆與表達分析 量最高 圖5 FaFRK3基因在 紅顏 草莓果實綠果期表達量最高 隨后逐漸降低 成熟期FaFRK3基因 表達量最低 圖6 信 號 肽 位 置 C score ATGGGGAGAAACCGAACCACCCACCTCACTTCCTCCCCTCGCCGCTGCCTGATTGCCGGACACTACTGCC S score Y score 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 位 置 分 值 10 20 30 40 50 60 700 圖3 紅顏 草莓FaFRK3蛋白信號肽預測 Fig 3 Signal peptide prediction of FaFRK protein in Benihoppe strawberry 2 5 2 0 1 5 1 0 0 5 0 0 5 1 0 位 置 分 值 200 400 600 8000 1 000 1 200 圖4 紅顏 草莓FaFRK3蛋白親疏水性分析 Fig 4 Hydrophobicity analysis of FaFRK3 protein in Benihoppe strawberry 器官 1 2 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 相 對 表 達 量 根 莖 葉 果 種子 圖5 紅顏 草莓不同器官中FaFRK3基因定量分析 Fig 5 Quantitative analysis of FaFRK3 gene in different organs of Benihoppe strawberry 發(fā)育時期 1 2 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 相 對 表 達 量 綠果期 白果期 轉(zhuǎn)色期 成熟期 圖6 紅顏 草莓不同發(fā)育時期FaFRK3基因定量分析 Fig 6 Quantitative analysis of FaFRK3 gene in different developmental stages of Benihoppe strawberry 3 結(jié)論與討論 植物中的FRK基因?qū)χ参锏墓欠e累具有明顯的影響 草莓果實中的FaFRK3蛋白氨基酸序列與 月季 Rosachinensis XP 024157436 1 中的氨基酸序列相似率高達90 16 與水蜜桃 Prunus persica XP 007205340 1 棗 Ziziphus jujuba XP 015873836 1 番木瓜 Carica papaya XP 021909927 1 克里曼丁 橘 Citrus clementina XP 006425063 1 等植物也高度同源 氨基酸序列比對分析表明 FaFRK3蛋白具有 pfkB糖激酶家族的明顯特征 屬于pfkB糖激酶家族 提示FaFRK3基因是 紅顏 草莓果實中果糖激酶蛋 白的關鍵編碼基因之一 定量表達分析發(fā)現(xiàn) FaFRK3基因在 紅顏 草莓果實不同發(fā)育時期的表達量差 別較大 并且在不同器官中相對表達量明顯不同 隨著 紅顏 草莓果實的成熟 FaFRK3基因的相對表達 量明顯減少 這與枸杞中的LbFRK7基因 16 和楊梅中的MrFRK2基因 20 表達趨勢分析結(jié)果一致 參 考 文 獻 1 王貴元 夏仁學 吳強盛 果實中糖分的積累與代謝研究進展 J 北方園藝 2007 3 56 58 2 李麗娜 孔建強 植物蔗糖合酶的結(jié)構(gòu) 功能及應用 J 中國生物化學與分子生物學報 2015 31 9 904 913 3 GRANOT D Role of tomato hexose kinases J Functional Plant Biology 2007 34 6 564 570 4 RIGGS J W CAVALES P C CHAPIRO S M et al Identification and biochemical characterization of the fructokinase gene family in Arabidopsis thaliana J BMC Plant Biology 2017 17 83 5 SMITH S B TAYLOR M A BURCH L R et al Primary structure and characterization of a cDNA clone of fructokinase from potato Solanum tuberosum L cv record J Plant physiology 1993 102 3 1043 6 COPELAND L TANNER G J Hexose kinases of avocado J Physiologia Plantarum 1988 74 3 531 536 4 上 海 農(nóng) 業(yè) 學 報 7 BAYSDORFER C KREMER D F SICHER R C Partial purification and characterization of fructokinase activity from barley leaves J Journal of Plant Physiology 1989 134 2 156 161 8 COPELAND L STONE S R TURNER J F Kinetic studies of fructokinase I of pea seeds J Archives of Biochemistry and Biophysics 1984 233 2 748 760 9 TURNER J F HARRISON D D COPELAND L Fructokinase fraction IV of pea seeds J Plant Physiology 1977 60 5 666 669 10 JIANG H DIAN W LIU F et al Isolation and characterization of two fructokinase cDNA clones from rice J Phytochemistry 2003 62 1 47 52 11 QIN Q P ZHANG S L CHEN J W et al Isolation and expression analysis of fructokinase genes from citrus J Acta Botanica Sinica 2004 46 12 1408 1415 12 陳毅鴻 甘蔗果糖激酶基因家族基因組演化及功能研究 D 福州 福建師范大學 2016 13 GONZALI S PISTELLI L DE BELLIS L et al Characterization of two fructokinases J Plant Science 2001 160 6 1107 1114 14 SUZUKI Y ODANAKA S KAMAYAMA Y Fructose content and fructose related enzyme activity during the fruit development of apple and Japanese pear J Journal of the Japanese Society for Horticultural Science 2001 70 1 16 20 15 QIN Q P CUI Y Y ZHANG L L et al Isolation and induced expression of a fructokinase gene from loquat J Russian Journal of Plant Physiology 2014 61 3 289 297 16 趙建華 尹躍 李浩霞 等 枸杞果糖激酶基因LbFRK7的克隆及表達分析 J 西北植物學報 2018 38 5 816 822 17 YANG J ZHU L CUI W et al Increased activity of MdFRK2 a high affinity fructokinase leads to upregulation of sorbitol metabolism and downregulation of sucrose metabolism in apple leaves J Horticulture Research 2018 5 71 18 郭姍姍 張蒙 單衛(wèi)星 基于Gateway技術的植物表達載體的構(gòu)建 J 西北農(nóng)林科技大學學報 自然科版 2010 38 11 161 166 172 19 呂文遠 張玲 王延秀 等 草莓蔗糖轉(zhuǎn)運基因FaSUT5對 申陽 草莓果實糖分積累的影響 J 江西農(nóng)業(yè)學報 2018 30 8 16 20 20 陳馨 施麗愉 邵佳蓉 等 楊梅果糖激酶基因MrFRK2的克隆及在成熟期果實中的表達分析 J 園藝學報 2016 43 8 1585 1592 責任編輯 閆其濤 5