一種石斛組培培養(yǎng)基及其應(yīng)用.pdf

19 中華人民共和國 國家知識產(chǎn)權(quán)局 12 發(fā)明專利申請 10 申請公布號 43 申請公布日 21 申請?zhí)?202010448376 4 22 申請日 2020 05 25 71 申請人 安徽農(nóng)業(yè)大 學(xué) 地址 230036 安徽省合肥市長江西路13 0號 72 發(fā)明人 劉林 董迎雪 向浩鑫 唐勝碩 樊洪泓 蔡永萍 彭代銀 74 專利代理機(jī)構(gòu) 北京方圓嘉 禾知識產(chǎn)權(quán)代理 有限公司 1 1385 代理人 李正 51 Int Cl A01G 31 00 2018 01 A01G 24 10 2018 01 A01G 24 30 2018 01 54 發(fā)明名稱 一種石斛組培 培 養(yǎng)基及其應(yīng)用 57 摘要 本發(fā)明提供了一種石斛組培培養(yǎng)基及其應(yīng) 用 屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域 所述組培培養(yǎng) 基以改良的MS固體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基 所述組 培培養(yǎng)基中磷濃度為60 65mmol L 利用本發(fā)明 的石斛組培培養(yǎng)基對石斛組培幼苗進(jìn)行培養(yǎng) 培 養(yǎng)得到的石斛植株長勢良好 并且能夠提高石斛 的有效成分 多糖 生物堿和單糖 含量 還能夠 減少磷的使用量 提高磷的利用率 權(quán)利要求書1頁 說明書5頁 附圖2頁 CN 111543299 A 2020 08 18 CN 111543299 A 1 一種石斛組培培養(yǎng)基 所述組培培養(yǎng)基以改良的MS固體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基 其特 征在于 所述組培培養(yǎng)基中磷濃度為60 65mmol L 2 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組培培養(yǎng)基 其特征在于 所述組培培養(yǎng)基中磷濃度為 62 5mmol L 3 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組培培養(yǎng)基 其特征在于 所述改良MS固體培養(yǎng)基以1L計 包 括以下組分 20mL母液 10mL母液 5mL母液 10mL母液 1mL母液 10mL母液 5mL 母液 10mL 6 芐氨基嘌呤母液 1mL萘乙酸母液 7g瓊脂 30g蔗糖 1g活性炭和余量蒸餾 水 所述母液 以1L計 包括以下組分 NH 4NO3 82 5g KNO 3 95g MgSO 4 9 032g 所述母液 的 溶劑為蒸餾水 所述母液 以1L計 包括以下組分 CaCl 2 33 2g 所述母液 的溶劑為蒸餾水 所述母液 以1L計 包括以下組分 KH 2PO4 17g 所述母液 的溶劑為蒸餾水 所述母液 以1L計 包括以下組分 Na EDTA 3 73g FeSO 4 7H2O 2 78g 所述母液 的 溶劑為蒸餾水 所述母液 以1L計 包括以下組分 H 3BO3 6 2g MnSO 4 4H2O 22 3g ZnSO 4 7H2O 8 6g KI 0 83g NaMoO 4 2H2O 0 25g CuSO 4 5H2O 0 025g CaCl 2 6H2O 0 025g 所述母液 的溶劑為蒸餾水 所述母液 以1L計 包括以下組分 肌醇10g 甘氨酸0 2g 煙酸0 05g 鹽酸吡哆酸 0 05g 鹽酸硫酸胺素0 01g 所述母液 的溶劑為蒸餾水 所述母液 以1L計 包括以下組分 KCl 9 375g 所述母液 的溶劑為蒸餾水 所述6 芐氨基嘌呤母液以1L計 包括以下組分 6 芐氨基腺嘌呤0 1g 所述6 芐氨基嘌 呤母液的溶劑為蒸餾水 加入幾滴1mol L HCl溶液助溶 所述萘乙酸母液以1L計 包括以下組分 萘乙酸0 1g 所述萘乙酸母液的溶劑為蒸餾 水 加入幾滴1mol L NaOH溶液助溶 4 根據(jù)權(quán)利要求1 3任意一項所述的組培培養(yǎng)基 其特征在于 所述組培培養(yǎng)基的pH 值為5 5 6 0 5 根據(jù)權(quán)利要求4所述的組培培養(yǎng)基 其特征在于 所述組培培養(yǎng)基的pH值為5 8 6 權(quán)利要求1 5任意一項所述組培培養(yǎng)基在提高石斛的活性成分含量中的應(yīng)用 7 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用 其特征在于 所述活性成分包括多糖 生物堿和單糖 8 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用 其特征在于 所述單糖包括甘露糖和葡萄糖 9 根據(jù)權(quán)利要求6 8任意一項所述的應(yīng)用 其特征在于 所述應(yīng)用包括以下步驟 將石 斛組培幼苗接種于所述組培培養(yǎng)基 于20 30 條件下培養(yǎng)40 60d 10 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用 其特征在于 所述培養(yǎng)的光照條件光強為800 mol m 2 s 1 權(quán) 利 要 求 書 1 1 頁 2 CN 111543299 A 一種石斛組培培養(yǎng)基及其應(yīng)用 技術(shù)領(lǐng)域 0001 本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域 尤其涉及一種石斛組培培養(yǎng)基及其應(yīng)用 背景技術(shù) 0002 石斛 Dendrobium officinale Kimura et Migo 屬于蘭科石斛屬 是多年生的附 生草本植物 是我國傳統(tǒng)并且極其名貴的中草藥 其新鮮或干燥莖又被稱為鐵皮蘭 黑節(jié) 草 石斛含有石斛多糖 生物堿 氨基酸 黃酮及微量元素等多種對人體健康有益的藥理成 分 0003 石斛多糖的藥效為其不僅能增強免疫系統(tǒng)功能 而且還具有較好的抑制癌癥 生 津名目等生物活性 同時在降血糖方面也有一定的效果 生物堿是普遍存在于各種石斛中 的一種成分 研究人員已從各種石斛中分離出29種生物堿 其中有16種倍半萜類生物堿 石 斛堿型倍半萜類生物堿的主要功效是解熱鎮(zhèn)痛 同時也具有抗腫瘤 降血脂 延緩衰老 改 善記憶等藥理作用 2015年版 中華人民共和國藥典 規(guī)定以多糖 甘露糖和醇溶性浸出物 為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行品質(zhì)控制 而甘露糖與葡萄糖峰面積之比則作為評價石斛品質(zhì)的一項重要 指標(biāo) 因此 如何提高石斛中的多糖和生物堿含量以及甘露糖與葡萄糖峰面積之比進(jìn)而提 高石斛品質(zhì)成為目前亟待解決的技術(shù)問題 發(fā)明內(nèi)容 0004 本發(fā)明的目的在于提供一種石斛組培培養(yǎng)基及其應(yīng)用 本發(fā)明的石斛組培培養(yǎng)基 能夠提高石斛中活性成分的含量 0005 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的 本發(fā)明提供以下技術(shù)方案 0006 本發(fā)明提供了一種石斛組培培養(yǎng)基 所述組培培養(yǎng)基以改良的MS固體培養(yǎng)基為基 礎(chǔ)培養(yǎng)基 所述組培培養(yǎng)基中磷濃度為60 65mmol L 0007 優(yōu)選的 所述組培培養(yǎng)基中磷濃度為62 5mmol L 0008 優(yōu)選的 所述MS固體培養(yǎng)基以1L計 包括以下組分 20mL母液 10mL母液 5mL母 液 10mL母液 1mL母液 10mL母液 5mL母液 10mL6 芐氨基嘌呤母液 1mL萘乙酸 母液 7g瓊脂 30g蔗糖 1g活性炭和余量蒸餾水 0009 所述母液 以1L計 包括以下組分 NH 4NO3 82 5g KNO 3 95g MgSO 4 9 032g 所述母 液 的溶劑為蒸餾水 0010 所述母液 以1L計 包括以下組分 CaCl 2 33 2g 所述母液 的溶劑為蒸餾水 0011 所述母液 以1L計 包括以下組分 KH 2PO4 17g 所述母液 的溶劑為蒸餾水 0012 所述母液 以1L計 包括以下組分 Na EDTA 3 73g FeSO 4 7H2O 2 78g 所述母液 的溶劑為蒸餾水 0013 所述母液 以1L計 包括以下組分 H 3BO3 6 2g MnSO 4 4H2O 22 3g ZnSO 4 7H2O 8 6g KI 0 83g NaMoO 4 2H2O 0 25g CuSO 4 5H2O 0 025g CaCl 2 6H2O 0 025g 所述母液 的溶劑為蒸餾水 說 明 書 1 5 頁 3 CN 111543299 A 0014 所述母液 以1L計 包括以下組分 肌醇 0g 甘氨酸0 2g 煙酸0 05g 鹽酸吡哆酸 0 05g 鹽酸硫酸胺素0 01g 所述母液 的溶劑為蒸餾水 0015 所述母液 以1L計 包括以下組分 KCl 9 375g 所述母液 的溶劑為蒸餾水 0016 所述6 芐氨基嘌呤母液以1L計 包括以下組分 6 芐氨基腺嘌呤0 1g 所述6 芐氨 基嘌呤母液的溶劑為蒸餾水 加入幾滴1mol L HCl溶液助溶 0017 所述萘乙酸母液以1L計 包括以下組分 萘乙酸0 1g 所述萘乙酸母液的溶劑為蒸 餾水 加入幾滴1mol L NaOH溶液助溶 0018 優(yōu)選的 所述組培培養(yǎng)基的pH值為5 5 6 0 0019 優(yōu)選的 所述組培培養(yǎng)基的pH值為5 8 0020 本發(fā)明提供了上述方案所述組培培養(yǎng)基在提高石斛的活性成分含量中的應(yīng)用 0021 優(yōu)選的 所述活性成分包括單糖 多糖和生物堿 0022 優(yōu)選的 所述單糖包括甘露糖和葡萄糖 0023 優(yōu)選的 所述應(yīng)用包括以下步驟 將石斛組培幼苗接種于所述組培培養(yǎng)基 于20 30 條件下培養(yǎng)40 60d 0024 優(yōu)選的 所述培養(yǎng)的光照條件為蒸餾水 0025 本發(fā)明的有益效果 本發(fā)明提供了一種石斛組培培養(yǎng)基 所述組培培養(yǎng)基以MS固 體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基 所述組培培養(yǎng)基中磷濃度為60 65mmol L 利用本發(fā)明的石斛組 培培養(yǎng)基對石斛組培幼苗進(jìn)行培養(yǎng) 培養(yǎng)得到的石斛植株長勢良好 并且能夠提高石斛的 有效成分 多糖 生物堿和單糖 含量 還能夠減少磷的使用量 提高磷的利用率 附圖說明 0026 圖1為不同磷濃度對石斛組培幼苗生長狀況的影響圖 0027 圖2為不同磷濃度對石斛組培幼苗中多糖含量影響圖 0028 圖3為為不同磷濃度對石斛組培幼苗中生物堿含量影響圖 0029 圖4為不同磷濃度對石斛組培幼苗中甘露糖與葡萄糖峰面積比值影響圖 具體實施方式 0030 本發(fā)明提供了一種石斛組培培養(yǎng)基 所述組培培養(yǎng)基以MS固體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng) 基 所述組培培養(yǎng)基中磷濃度為60 65mmol L 優(yōu)選為62 5mmol L 0031 本發(fā)明所述組培培養(yǎng)基通過適當(dāng)減少磷的添加量 不僅不會抑制石斛組培幼苗生 長 而且能夠提高石斛中多糖 生物堿 甘露糖和葡萄糖的含量 0032 本發(fā)明中 所述MS固體培養(yǎng)基由大量元素 微量元素 鐵鹽 有機(jī)元素 蔗糖 激素 和活性炭組成 0033 本發(fā)明中 所述MS固體培養(yǎng)基以1L計 優(yōu)選的包括以下組分 20mL母液 10mL母液 5mL母液 10mL母液 1mL母液 10mL母液 10mL6 芐氨基嘌呤母液 1mL萘乙酸母 液 7g瓊脂 30g蔗糖 1g活性炭和余量蒸餾水 0034 本發(fā)明中 所述母液 以1L計 優(yōu)選的包括以下組分 NH 4NO3 82 5g KNO 3 95g MgSO4 9 032g 所述母液 的溶劑優(yōu)選為蒸餾水 0035 本發(fā)明中 所述母液 以1L計 優(yōu)選的包括以下組分 CaCl 2 33 2g 所述母液 的 說 明 書 2 5 頁 4 CN 111543299 A 溶劑優(yōu)選為蒸餾水 0036 本發(fā)明中 所述母液 以1L計 優(yōu)選的包括以下組分 KH 2PO4 17g 所述母液 的溶 劑優(yōu)選為蒸餾水 0037 本發(fā)明中 所述母液 以1L計 優(yōu)選的包括以下組分 Na EDTA 3 73g FeSO 4 7H2O 2 78g 所述母液 的溶劑優(yōu)選為蒸餾水 0038 本發(fā)明中 所述母液 以1L計 優(yōu)選的包括以下組分 H 3BO3 6 2g MnSO 4 4H2O 22 3g ZnSO 4 7H2O 8 6g KI 0 83g NaMoO 4 2H2O 0 25g CuSO 4 5H2O 0 025g CaCl 2 6H2O 0 025g 所述母液 的溶劑優(yōu)選為蒸餾水 0039 本發(fā)明中 所述母液 以1L計 優(yōu)選的包括以下組分 肌醇10g 甘氨酸0 2g 煙酸 0 05g 鹽酸吡哆酸0 05g 鹽酸硫酸胺素0 01g 所述母液 的溶劑優(yōu)選為蒸餾水 0040 本發(fā)明中 所述母液 以1L計 優(yōu)選的包括以下組分 KCl 9 375g 所述母液 的 溶劑優(yōu)選為蒸餾水 0041 本發(fā)明中 所述6 芐氨基嘌呤母液以1L計 優(yōu)選的包括以下組分 6 芐氨基腺嘌呤 6 BA 0 1g 所述6 芐氨基嘌呤母液的溶劑優(yōu)選為蒸餾水 加入幾滴1mol L HCl溶液助溶 0042 本發(fā)明中 所述萘乙酸母液以1L計 優(yōu)選的包括以下組分 萘乙酸 NAA 0 1g 所述 萘乙酸母液的溶劑優(yōu)選為蒸餾水 加入幾滴1mol L NaOH溶液助溶 0043 本發(fā)明中 所述組培培養(yǎng)基的pH值優(yōu)選為5 5 6 0 更優(yōu)選為5 8 0044 本發(fā)明提供了上述方案所述組培培養(yǎng)基在提高石斛的活性成分含量中的應(yīng)用 所 述活性成分優(yōu)選的包括單糖 多糖和生物堿 所述單糖優(yōu)選的包括甘露糖和葡萄糖 0045 本發(fā)明中 所述應(yīng)用優(yōu)選的包括以下步驟 將石斛組培幼苗接種于所述組培培養(yǎng) 基 于20 30 條件下培養(yǎng)40 60d 所述培養(yǎng)的光照條件優(yōu)選為光強為800 mol m 2 s 1 溫度優(yōu)選為25 0046 本發(fā)明對所述石斛組培幼苗的來源沒有特殊限制 采用常規(guī)長勢良好的石斛組培 幼苗即可 本發(fā)明具體實施過程中 所述石斛幼苗由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)地方特色植物資源開發(fā) 與利用安徽省工程技術(shù)研究中心提供 0047 下面將結(jié)合本發(fā)明中的實施例 對本發(fā)明中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚 完整地描述 顯 然 所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例 而不是全部的實施例 基于本發(fā)明中的實 施例 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例 都屬 于本發(fā)明保護(hù)的范圍 0048 實施例1一種提高石斛活性成分含量的培養(yǎng)方法 0049 1 按照表 配方配制MS固體培養(yǎng)基各成分母液 0050 表1 MS固體培養(yǎng)基各母液配方 說 明 書 3 5 頁 5 CN 111543299 A 0051 0052 所述的MS固體培養(yǎng)基按以下配制 1L pH 5 8 分別取母液 20mL 母液 10mL 母液 5mL 對應(yīng)的磷濃度為62 5mmol L 母液 10mL 母液 1mL 母液 10mL 母液 5mL 6 BA母液 10mL NAA母液 1mL 瓊脂 7g 蔗糖 30g 活性炭1g 蒸餾水定容至1L 調(diào) 節(jié)pH值為5 8 0053 2 以安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)地方特色植物資源開發(fā)與利用安徽省工程技術(shù)研究中心培養(yǎng) 的同一批次長勢良好 大小相似的鐵皮石斛組培幼苗為原材料 轉(zhuǎn)接到MS固體培養(yǎng)基中于 25 光強800 mol m 2 s 1條件下培養(yǎng)40d 說 明 書 4 5 頁 6 CN 111543299 A 0054 3 取出MS固體培養(yǎng)基中生長的鐵皮石斛組培幼苗 105 殺青0 5h 60 烘至恒 重 研磨成粉末 分別使用苯酚 硫酸法 酸性染料比色法 高效液相色譜法檢測多糖 生物 堿以及單糖組分 結(jié)果如圖1 3顯示 0055 對比例1 0056 除MS固體培養(yǎng)基中母液 為20mL 母液 為0mL外 對于含有不同磷濃度的MS固體 培養(yǎng)基 用相同摩爾濃度的KCl代替KH 2PO4 其余與實施例1相同 0057 對比例2 0058 除MS固體培養(yǎng)基中母液 體積為10mL 母液 為0mL外 對于含有不同磷濃度的MS 固體培養(yǎng)基 用相同摩爾濃度的KCl代替KH 2PO4 其余與實施例1相同 0059 對比例3 0060 除MS固體培養(yǎng)基中母液 體積為0 5mL 母液 為9 5mL外 對于含有不同磷濃度 的MS固體培養(yǎng)基 用相同摩爾濃度的KCl代替KH 2PO4 其余與實施例1相同 0061 對比例4 0062 除MS固體培養(yǎng)基中母液 為0mL 母液 為10mL外 對于含有不同磷濃度的MS固體 培養(yǎng)基 用相同摩爾濃度的KCl代替KH 2PO4 其余與實施例1相同 0063 由圖2 圖4可知 當(dāng)組培培養(yǎng)基中磷濃度為62 5mmol L時 多糖與生物堿含量較 對照組CK升高 并且甘露糖與葡萄糖峰面積比為其中的最大值 說明本發(fā)明提供的組培培 養(yǎng)基能夠有效提高石斛中活性成分的含量 0064 如表2 圖1所示 其中圖 中的1表示磷濃度為250mmol L 2表示125mmol L 3表示 62 5mmol L 4表示6 25mmol L 5表示0mmol L條件下生長的石斛組培苗 其中2為對照組CK 本發(fā)明中磷濃度125mmol L為原MS培養(yǎng)基中磷濃度 是對照組CK 隨著磷濃度的降低 石 斛組培幼苗中有效活性成分多糖和生物堿的含量升高 但植株生長狀況受磷水平的限制 當(dāng)組培培養(yǎng)基中磷濃度為62 5mmol L時 與對照組CK相比 對植株生長的影響不大 0065 表2 不同磷濃度對石斛有效成分的影響 0066 0067 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式 應(yīng)當(dāng)指出 對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說 在不脫離本發(fā)明原理的前提下 還可以做出若干改進(jìn)和潤飾 這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護(hù)范圍 說 明 書 5 5 頁 7 CN 111543299 A 圖1 圖2 說 明 書 附 圖 1 2 頁 8 CN 111543299 A 圖3 圖4 說 明 書 附 圖 2 2 頁 9 CN 111543299 A