一種脫毒蝴蝶蘭新品種培育及組培擴(kuò)繁方法.pdf

19 中華人民共和國 國家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局 12 發(fā)明專利申請(qǐng) 10 申請(qǐng)公布號(hào) 43 申請(qǐng)公布日 21 申請(qǐng)?zhí)?202010461202 1 22 申請(qǐng)日 2020 05 27 71 申請(qǐng)人 山東省農(nóng)業(yè)科 學(xué)院蔬菜花 卉研究所 地址 250100 山東省濟(jì)南市歷城區(qū)工業(yè)北 路202號(hào) 申請(qǐng)人 濟(jì)南麒 麟花 卉有限公司 72 發(fā)明人 呂曉惠 董飛 王燁楠 王俊峰 朱嬌 蘭成云 石少川 泮海 軍 張冀華 馬蕾 74 專利代理機(jī)構(gòu) 濟(jì)南誠智商標(biāo)專利事務(wù)所有 限公司 3710 5 代理人 韓百翠 51 Int Cl A01H 4 00 2006 01 54 發(fā)明名稱 一種脫毒蝴蝶蘭新品種培育及組培擴(kuò)繁方 法 57 摘要 本發(fā)明公開了一種脫毒蝴蝶蘭新品種培育 及組培擴(kuò)繁方法 本發(fā)明在果莢自然開裂后 用 鑷子輕敲果莢 種子可自裂口處蹦出 表面滅菌 用折成漏斗狀的滅菌濾紙 過濾出種子 從而獲得 了無附屬物的無毒種子 然后無菌播種 獲得蝴 蝶蘭無病毒實(shí)生苗 配合田間養(yǎng)護(hù)做好病毒防 控 優(yōu)選單株在擴(kuò)繁前進(jìn)行病毒檢測(cè) 只選擇無 病毒的株系進(jìn)行擴(kuò)繁 進(jìn)而在獲得新品種的同時(shí) 獲得無病毒種苗 提供無病毒組培母瓶 緩解蝴 蝶蘭產(chǎn)業(yè)中急需的新品種和無病毒種苗需求 權(quán)利要求書1頁 說明書5頁 附圖3頁 CN 111543322 A 2020 08 18 CN 111543322 A 1 一種脫毒蝴蝶蘭新品種培育及組培擴(kuò)繁方法 其特征是 包括以下步驟 1 獲得雜交果莢 選取性狀表現(xiàn)優(yōu)良的父 母本進(jìn)行雜交獲得果莢 將未開裂但發(fā)育成熟的果莢進(jìn)行消 毒 2 開裂果莢播種 將消毒過的果莢放在無菌組培瓶中 使其自然開裂 待果莢開裂后 輕敲果莢 種子自 裂口處蹦出 先次氯酸鈉消毒 然后采用折成漏斗狀的滅菌濾紙過濾出種子 再播種到培養(yǎng) 基上 3 無菌培養(yǎng)獲得組培實(shí)生苗 將種子暗處理2周 之后進(jìn)行正常的培養(yǎng) 實(shí)生苗田間養(yǎng)護(hù)期間配合做好病毒防控 4 優(yōu)秀實(shí)生單株擴(kuò)繁 實(shí)生苗開花后 挑選出優(yōu)秀的實(shí)生單株 逐一進(jìn)行病毒檢測(cè) 顯示不含建蘭花葉病毒和 齒蘭環(huán)斑病毒的單株在組培室內(nèi)進(jìn)行蝴蝶蘭花梗組培擴(kuò)繁 獲得初代母瓶 5 保留組培母瓶 在經(jīng)過品種測(cè)試后 確定推廣應(yīng)用的品種 直接從組培室內(nèi)用初代母瓶進(jìn)行擴(kuò)繁 生產(chǎn) 過程中根據(jù)組培苗長勢(shì)進(jìn)行復(fù)壯擴(kuò)增 2 如權(quán)利要求1所述的一種脫毒蝴蝶蘭新品種培育及組培擴(kuò)繁方法 其特征是 所述步 驟2 次氯酸鈉消毒為 采用0 5 的次氯酸鈉消毒8 10分鐘 3 如權(quán)利要求1所述的一種脫毒蝴蝶蘭新品種培育及組培擴(kuò)繁方法 其特征是 所述步 驟2 的培養(yǎng)基為 花寶1號(hào) 香蕉50g L 蛋白胨2g L 蔗糖20g L 瓊脂8g L 活性炭2g L pH 5 4 5 6 4 如權(quán)利要求1所述的一種脫毒蝴蝶蘭新品種培育及組培擴(kuò)繁方法 其特征是 所述步 驟2 的正常的培養(yǎng)為 光照強(qiáng)度2500lx 光周期14h 溫度保持在20 26 權(quán) 利 要 求 書 1 1 頁 2 CN 111543322 A 一種脫毒蝴蝶蘭新品種培育及組培擴(kuò)繁方法 技術(shù)領(lǐng)域 0001 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域 具體涉及一種脫毒蝴蝶蘭新品種培育及組培擴(kuò)繁方 法 背景技術(shù) 0002 蝴蝶蘭為蘭科蝴蝶蘭屬植物 因其花形奇特 花姿優(yōu)美 花色艷麗 花期長等優(yōu)點(diǎn) 深受消費(fèi)者青睞 被譽(yù)為 蘭花皇后 常作盆栽或切花 隨著國際花卉產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展 我 國蝴蝶蘭產(chǎn)業(yè)呈現(xiàn)出快速化 標(biāo)準(zhǔn)化 規(guī)模化的發(fā)展態(tài)勢(shì) 發(fā)展前景可觀 0003 蝴蝶蘭只有一個(gè)生長點(diǎn) 屬單莖性蘭花 所以蝴蝶蘭很難進(jìn)行分株繁殖 目前國際 上常用的繁殖方法是組織培養(yǎng)無性繁殖法 但是長期的組織培養(yǎng)引發(fā)的病毒傳播越來越 重 目前 在蝴蝶蘭上分離得到的病毒超過25種 其中危害最重 分布最廣的是建蘭花葉病 毒 Cybidium mosaic virus CymMV 和齒蘭環(huán)斑病毒 Odontoglossum ringspot virus ORSV 病毒傳播成為制約蘭花產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸 病毒主要造成植株花葉 畸形 壞死 花瓣 變形等癥狀 導(dǎo)致植株生長不良 花小而少 花期縮短 嚴(yán)重影響其觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值 0004 迄今為止 獲得無毒苗的主要途徑有莖尖剝離 熱處理和病毒抑制劑等方法 其 中 莖尖培養(yǎng)應(yīng)用最廣 但其脫毒效果常受莖尖大小的影響 而且莖尖褐化和死亡率高 熱 處理主要利用高溫可以抑制病毒的復(fù)制及運(yùn)動(dòng)蛋白的合成 從而造成病毒鈍化失活 然而 研究表明 CymMV和ORSV都具有一定的耐熱性 因此 單獨(dú)熱處理對(duì)蝴蝶蘭脫除CymMV和ORSV 效果不明顯 病毒抑制劑方法主要通過抑制劑 孔雀綠 病毒唑和氨基寡糖素等 干擾病毒 在植物體內(nèi)的復(fù)制來達(dá)到防治病毒病的目的 但是 病毒抑制劑的濃度很難把控 濃度太大 會(huì)使莖尖死亡 濃度小無法實(shí)現(xiàn)脫毒 0005 由于蝴蝶蘭脫毒技術(shù)成活率低 目前我國大陸蝴蝶蘭組培生產(chǎn)所需組培苗母瓶幾 乎全部購自中國臺(tái)灣 荷蘭等地 價(jià)格昂貴 中國大陸組培廠利用購買的蝴蝶蘭母瓶擴(kuò)繁后 為產(chǎn)業(yè)提供組培苗 然而 購買的母瓶往往是很多代擴(kuò)繁的產(chǎn)物 也會(huì)有單病毒或含量比較 低的病毒 隨著中國大陸組培操作的不規(guī)范 往往擴(kuò)繁幾代生產(chǎn)種苗后就無法繼續(xù)使用 需 要年年購買 如何獲得低成本的無病毒植株是蝴蝶蘭產(chǎn)業(yè)中的 卡脖子 問題 發(fā)明內(nèi)容 0006 針對(duì)上述問題 本發(fā)明提供了一種脫毒蝴蝶蘭新品種培育及組培擴(kuò)繁方法 本發(fā) 明通過開裂果莢的無菌播種 獲得蝴蝶蘭無病毒實(shí)生苗 配合田間養(yǎng)護(hù)做好病毒防控 優(yōu)選 單株在擴(kuò)繁前進(jìn)行病毒檢測(cè) 只選擇無病毒的株系進(jìn)行擴(kuò)繁 進(jìn)而在獲得新品種的同時(shí)獲 得無病毒種苗 提供無病毒組培母瓶 緩解蝴蝶蘭產(chǎn)業(yè)中急需的新品種和無病毒種苗需求 0007 本發(fā)明技術(shù)方案是 一種脫毒蝴蝶蘭新品種培育及組培擴(kuò)繁方法 其特征是 包括 以下步驟 0008 1 獲得雜交果莢 0009 選取性狀表現(xiàn)優(yōu)良的父 母本進(jìn)行雜交獲得果莢 將未開裂但發(fā)育成熟的果莢進(jìn) 說 明 書 1 5 頁 3 CN 111543322 A 行消毒 0010 2 開裂果莢播種 0011 將消毒過的果莢放在無菌組培瓶中 使其自然開裂 待果莢開裂后 輕敲果莢 種 子自裂口處蹦出 先次氯酸鈉消毒 然后采用折成漏斗狀的滅菌濾紙過濾出種子 再播種到 培養(yǎng)基上 0012 3 無菌培養(yǎng)獲得組培實(shí)生苗 0013 將種子暗處理2周 之后進(jìn)行正常的培養(yǎng) 實(shí)生苗田間養(yǎng)護(hù)期間配合做好病毒防 控 0014 4 優(yōu)秀實(shí)生單株擴(kuò)繁 0015 實(shí)生苗開花后 挑選出優(yōu)秀的實(shí)生單株 逐一進(jìn)行病毒檢測(cè) 顯示不含建蘭花葉病 毒和齒蘭環(huán)斑病毒的單株在組培室內(nèi)進(jìn)行蝴蝶蘭花梗組培擴(kuò)繁 獲得初代母瓶 0016 5 保留組培母瓶 0017 在經(jīng)過品種測(cè)試后 確定推廣應(yīng)用的品種 直接從組培室內(nèi)用初代母瓶進(jìn)行擴(kuò)繁 確保種苗不含建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒 生產(chǎn)過程中根據(jù)組培苗長勢(shì)進(jìn)行復(fù)壯擴(kuò)增 0018 優(yōu)選的 所述步驟1 將未開裂但發(fā)育成熟的果莢進(jìn)行消毒 具體為 將未開裂但發(fā) 育成熟的果莢 用75 乙醇仔細(xì)擦拭果莢表面及溝紋 將一些污垢和塵土擦拭干凈 然后將 整個(gè)果莢放入消毒過的容器中 用0 5 的次氯酸鈉消毒15 18分鐘 無菌水沖洗2 3次 吸 干待用 0019 優(yōu)選的 所述步驟2 次氯酸鈉消毒為 采用0 5 的次氯酸鈉消毒8 10分鐘 0020 優(yōu)選的 所述步驟2 的培養(yǎng)基為 花寶1號(hào) 香蕉50g L 蛋白胨2g L 蔗糖20g L 瓊脂8g L 活性炭2g L pH 5 4 5 6 0021 優(yōu)選的 所述步驟2 的正常的培養(yǎng)為 光照強(qiáng)度2500lx 光周期14h 溫度保持在20 26 0022 相比現(xiàn)有技術(shù) 本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)是 0023 1 獲得無附屬物的無病毒蝴蝶蘭種子和無病毒實(shí)生苗 0024 蝴蝶蘭的種子非常特別 每個(gè)果莢內(nèi)種子量巨大 上萬至幾十萬 種子細(xì)如粉塵 附著在絨毛上 0025 現(xiàn)有技術(shù)采用果莢切開獲得種子 果莢內(nèi)切出的都是絮狀物的絨毛 這些絮狀物 的絨毛上面有種子 種子細(xì)如粉塵 肉眼看不到 無法使用工具取出果莢內(nèi)細(xì)如粉塵的種 子 只能得到帶絨毛等附屬物的種子 絨毛由母本細(xì)胞分化而來 因此攜帶有病毒 而種子 為胚細(xì)胞發(fā)育而來 父母本各提供一半的遺傳物質(zhì) 由于建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒都 是RNA病毒 因此胚細(xì)胞發(fā)育而成的種子不含病毒 0026 針對(duì)上述問題 本發(fā)明在果莢自然開裂后 用鑷子輕敲果莢 種子可自裂口處蹦 出 表面滅菌 用折成漏斗狀的滅菌濾紙過濾出種子 從而獲得了無附屬物的無毒種子 0027 本發(fā)明采用兩次滅菌法 果莢滅菌 種子滅菌 利用無附屬物的種子進(jìn)行無菌播 種 截?cái)嗖《敬鷤鞑サ耐緩?通過無菌播種獲得無病毒實(shí)生苗 0028 2 將新品種選育和無病毒種苗的獲得結(jié)合在一起 0029 本發(fā)明首先獲得開裂果莢的無附屬物的無毒種子 通過無菌播種獲得無病毒實(shí)生 苗 制定嚴(yán)格的溫室 管理 操作 檢測(cè)流程 確保生長過程中的病毒無感染 優(yōu)選單株在擴(kuò) 說 明 書 2 5 頁 4 CN 111543322 A 繁前進(jìn)行病毒檢測(cè) 只選擇無病毒的株系進(jìn)行擴(kuò)繁 進(jìn)而在獲得新品種的同時(shí)獲得無病毒 種苗 提供無病毒組培母瓶 緩解蝴蝶蘭產(chǎn)業(yè)中急需的新品種和無病毒種苗需求 本發(fā)明將 新品種選育和無病毒種苗的獲得結(jié)合在一起 解決了品種脫毒種苗獲得極其困難的問題 可以改變中國大陸組培廠去中國臺(tái)灣買母瓶的現(xiàn)狀 0030 備注 本發(fā)明中提到的 無病毒 種苗并不是絕對(duì)的不含有任何病毒 而是不含在 生產(chǎn)中會(huì)影響商品性的兩種主要病毒 也不是絕對(duì)意義上的無毒苗 存在病毒含量極低 檢 測(cè)不出來的情況 但均不影響商品性 附圖說明 0031 圖1為不開裂蝴蝶蘭果莢通過解剖刀切開后的圖片 其中A圖為切開果莢的圖片 B 為從果莢內(nèi)取出的絨毛圖片 從圖中可以看出 從果莢內(nèi)切出的都是絮狀物的絨毛 這些絮 狀物的絨毛上面有種子 種子細(xì)如粉塵 肉眼看不到 無法使用工具 如刀片等 取出果莢內(nèi) 細(xì)如粉塵的種子 只能得到帶絨毛的種子 0032 圖2為蝴蝶蘭果莢自然開裂后的種子獲取圖片 其中A圖為鑷子輕敲果莢后種子可 自裂口處蹦出 B圖為種子滅菌圖片 C圖為將濾紙折成漏洞狀 用滅菌濾紙過濾出種子 0033 圖3為蝴蝶蘭建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒RT PCR產(chǎn)物電泳圖 其中 M arker A1 A2 A3為切開果莢得到種子后的播種苗 B1 B2 B3為果莢自然開裂得到種子后的播種 苗 769bp為建蘭花葉病毒特異擴(kuò)增帶 具體實(shí)施方式 0034 實(shí)施例1 0035 1無菌播種獲得無病毒實(shí)生苗 0036 1 1獲得雜交果莢 0037 選取性狀表現(xiàn)優(yōu)良的父 母本進(jìn)行雜交 以 V31 為母本 紅太陽 為父本 獲得果 莢 經(jīng)檢測(cè) 父母本均帶有兩種病毒 建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒 0038 1 2外植體消毒 0039 將未開裂但發(fā)育成熟的果莢 用75 乙醇仔細(xì)擦拭果莢表面及溝紋 將一些污垢 和塵土擦拭干凈 然后將整個(gè)果莢放入消毒過的容器中 用0 5 的次氯酸鈉消毒15 18分 鐘 無菌水沖洗2 3次 吸干待用 0040 1 3播種 0041 1 3 1未開裂果莢播種 作為對(duì)照 0042 將一部分消毒過的果莢放在無菌的培養(yǎng)皿中 用消毒過的解剖刀切開果莢 見圖 1 將果莢內(nèi)種子 帶有絨毛等附屬物 移入有少量無菌蒸餾水的培養(yǎng)瓶中 輕輕搖動(dòng)使之 分散均勻 然后用無菌吸管將種子分移到滅菌好的培養(yǎng)基 花寶1號(hào) 香蕉50g L 蛋白胨2g L 蔗糖20g L 瓊脂8g L 活性炭2g L pH 5 4 5 6 上 0043 1 3 2開裂果莢播種 0044 另一部分消毒過的果莢放在無菌組培瓶 放入無菌干燥劑 中 使其自然開裂 一 般15 30 天果莢才能裂開 果莢開裂后 用鑷子輕敲果莢 種子可自裂口處蹦出 見圖2 A 不要用鑷子等器物刮取 防治絨毛混雜在種子中 果莢自然開裂后的種子 表面滅菌后再進(jìn) 說 明 書 3 5 頁 5 CN 111543322 A 行播種 由于種子非常細(xì)小 需提前準(zhǔn)備折成漏斗狀的濾紙并滅菌 即把濾紙折成漏洞狀 用紙包好后用滅菌鍋滅菌 在超凈臺(tái)上 將裂開的種子用0 5 的次氯酸鈉消毒10分鐘 用 滅菌濾紙過濾出種子 見圖2 B和2 C 無菌水沖洗2 3次 然后再播種到培養(yǎng)基上 培養(yǎng)基 為 花寶1號(hào) 香蕉50g L 蛋白胨2g L 蔗糖20g L 瓊脂8g L 活性炭2g L pH 5 4 5 6 裂 開種子由于在瓶子中放置時(shí)間較長 不滅菌的話污染率較高 0045 1 4無菌培養(yǎng)獲得組培實(shí)生苗 0046 將兩種不同播種方法的種子暗處理2周 之后進(jìn)行正常的培養(yǎng) 光照強(qiáng)度 500lx 光周期14h 溫度保持在20 26 播種50 60天后長成2 3片葉的小苗 待小苗葉片長至 2cm 左右 取蝴蝶蘭葉片進(jìn)行病毒檢測(cè) 0047 檢測(cè)方法如下 利用RT PCR進(jìn)行病毒檢測(cè) 用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒提取蝴蝶蘭RNA 用TaKaRa PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄 用TaKaRa Ex DNA Polymerase進(jìn)行擴(kuò)增 結(jié)果如3所 示 由圖3可以看出 切開果莢得到種子 然后將其進(jìn)行播種后得到的種子苗 經(jīng)檢測(cè)只含有 建蘭花葉病毒 用果莢自然開裂后得到的種子進(jìn)行播種 得到的種子苗經(jīng)檢測(cè)不含有建蘭 花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒 因此 我們認(rèn)為 通過播種果莢自然開裂得到的種子 無絨毛等 附屬物 可以快速得到無毒蝴蝶蘭幼苗 0048 2無病毒實(shí)生苗的田間養(yǎng)護(hù) 0049 實(shí)生苗田間日常管理參照蝴蝶蘭生產(chǎn)技術(shù) 為做好田間管理過程中的病毒防護(hù)需 要符合如下要求 0050 2 1溫室要求 0051 溫室出入口 天窗 濕簾 風(fēng)機(jī)等于外界進(jìn)行氣體交換的部位需覆蓋40目防蟲網(wǎng) 入口及出口處須有緩沖隔離間 防止人員進(jìn)出時(shí)與外界直接進(jìn)行氣體交換 溫室地面需全 部用水泥硬化 防止土壤中害蟲入侵 溫室苗床必須用可耐燃燒的材質(zhì) 不可用木 竹等材 料 苗床支柱距離地面70 80cm處用銅片纏繞 可預(yù)防害蟲 0052 2 2管理要求 0053 理想狀態(tài)下 每半年進(jìn)行一次例行病毒鑒定 發(fā)現(xiàn)病毒感染及時(shí)剔除 溫室進(jìn)出人 員嚴(yán)格管理 減少人為接觸造成感染的機(jī)會(huì) 適當(dāng)放大實(shí)生苗的間距 以葉片互不碰觸為 準(zhǔn) 在換盆以及溫室內(nèi)更換位置時(shí) 需事先用0 5 的次氯酸鈉溶液對(duì)放置區(qū)域進(jìn)行充分淋 洗并干燥后才能放置 實(shí)生苗需要換盆 整理 雜交授粉時(shí) 使用工具需經(jīng)消毒處理 單株單 刀片 隨株更換 不得重復(fù)使用 人員管理操作時(shí)最好佩戴手套 并隨植株的更換做好收到 消毒 0054 工具和手套消毒可采用如下方法之一 1 在180 烘箱中維持1小時(shí) 2 沸水煮15 分鐘 3 工具上接觸過植物汁液的部位用火焰烤10 20秒 4 用0 5 的次氯酸鈉溶液浸泡 30 秒以上 溶液需現(xiàn)用現(xiàn)配 溫室內(nèi)應(yīng)保持整潔 植株殘?bào)w隨時(shí)清除 地面定期清掃 必要 時(shí)用0 5 次氯酸鈉溶液噴灑 人員接觸頻繁的部位 如門把 電器開關(guān) 澆水噴頭 掃把或 工作臺(tái)面 定期用0 5 次氯酸鈉溶液擦拭 植株生長所用的盆器 基質(zhì) 花梗固定器材等 采用全新資材 需要更替使用時(shí)必須用0 5 次氯酸鈉溶液充分浸泡重復(fù)使用 0055 3優(yōu)秀實(shí)生單株擴(kuò)繁 0056 實(shí)生苗開花后 挑選出優(yōu)秀的實(shí)生單株 逐一檢測(cè) 顯示不含建蘭花葉病毒和齒蘭 說 明 書 4 5 頁 6 CN 111543322 A 環(huán)斑病毒的單株進(jìn)行組培擴(kuò)繁 避免種子消毒不徹底及田間管理過程中病毒防護(hù)不利引起 植株帶毒 帶毒單株不會(huì)超過總體單株的5 參照蝴蝶蘭花梗組培擴(kuò)繁操作流程 0057 需要注意 組培過程中使用的器皿架 操作盤 刀片等 必須隨不同來源 批號(hào) 的 種苗進(jìn)行更換 確保不同單株擴(kuò)繁的群體不會(huì)存在交叉感染的風(fēng)險(xiǎn) 0058 4保留組培母瓶 0059 在經(jīng)過品種測(cè)試后 確定推廣應(yīng)用的品種 可直接從組培室內(nèi)用初代母瓶進(jìn)行擴(kuò) 繁 確保種苗不含建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒 生產(chǎn)過程中根據(jù)組培苗長勢(shì)進(jìn)行復(fù)壯擴(kuò) 增 說 明 書 5 5 頁 7 CN 111543322 A 圖1 說 明 書 附 圖 1 3 頁 8 CN 111543322 A 圖2 說 明 書 附 圖 2 3 頁 9 CN 111543322 A 圖3 說 明 書 附 圖 3 3 頁 10 CN 111543322 A