復(fù)合促生菌株篩選及其對(duì)油菜、黃瓜幼苗的促生效果.pdf

15 Vegetables 2020 6 試驗(yàn)研究 復(fù)合促生菌株篩選及其對(duì)油菜 黃瓜幼苗的促生效果 張 亮 1 盛 浩 1 譚 麗 2 袁 紅 1 易建平 3 鄧立平 4 1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院 湖南 長(zhǎng)沙 410128 2 醴陵市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局土壤肥料工作站 湖南 醴陵 412200 3 醴陵市 農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 湖南 醴陵 412200 4 醴陵市農(nóng)技推廣中心 湖南 醴陵 412200 收稿日期 2020 03 11 基金項(xiàng)目 國(guó)家自然科學(xué)基金 41571234 湖南省自然科學(xué)基金 2019JJ50259 1515 學(xué)術(shù)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)帶頭人培養(yǎng) 項(xiàng)目 通訊作者 譚麗 摘要 為了篩選獲得復(fù)合型功能微生物 PGPR 菌株材料 進(jìn)而從功能微生物的角度理解稻 油輪 作制度的優(yōu)勢(shì) 以稻 稻 稻 油輪作制度下耕層水稻土壤作為篩選源 采用選擇性培養(yǎng)基傳統(tǒng)培養(yǎng)法 對(duì)可培養(yǎng)細(xì)菌 固氮菌 解磷菌以及產(chǎn)IAA 菌株進(jìn)行分離和篩選 并利用人工氣候箱培育試驗(yàn)驗(yàn)證了對(duì) 部分篩選獲得的復(fù)合型促生菌株對(duì)油菜 黃瓜幼苗早期生物促生效果 結(jié)果表明 稻 稻輪作耕層土壤 可分離固氮菌35株 解磷菌3 株 稻 油輪作耕層土壤可分離固氮菌38株 解磷菌35株 具有固氮 解磷 以及較強(qiáng)生長(zhǎng)素分泌能力的復(fù)合型促生菌株6株 其普遍對(duì)油菜和黃瓜早期幼苗株高生長(zhǎng)具有一定的促生 效果 可分別提高25 45 111 96 和4 45 18 22 此外 DD 69和DY 111 菌株對(duì)黃瓜根長(zhǎng) D Y 6 和 DD 79菌株對(duì)黃瓜鮮質(zhì)量具有顯著的促生作用 關(guān)鍵詞 植物根際促生菌 輪作 水稻土 菌株篩選 油菜 黃瓜 Screening of Multifunctional PGPR and Their Promotion Effects on Rape and Cucumber Seedlings ZHANG Liang 1 SHENG Hao 1 TAN Li 2 YUAN Hong 1 YI Jianping 3 DENG Liping 4 1 College of Resources and Environment Hunan Agricultural University Changsha 410128 China 2 Soil Fertilizer Work Station Liling Agricultural and Rural Bureau Liling 412200 China 3 Liling Agricultural and Rural Bureau Liling 412200 China 4 Liling Agricultural Technology Extension Center Liling 412200 China Abstract In order to obtain the materials of composite functional microbial PGPR strains and then understand the advantages of rice rape system from the perspective of functional microorganisms using the arable soil of rice rice and rice rape system as the screening sources the cultivable bacteria nitrogen fixing bacteria NFB phosphate solubilizing bacteria PSB and auxin bacteria AB were isolated and screened by traditional selective medium culture method In the incubator culture experiment the early biological growth promoting effect of some selected compound growth promoting strains on rape and cucumber seedlings was verified The results showed that 35 strains of NFB strains and 3 PSB strains could be isolated from top 16 Vegetables 2020 6 試驗(yàn)研究 化肥和農(nóng)藥在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作 用 然而隨著化肥與農(nóng)藥使用量的逐年增加 其 殘留物對(duì)環(huán)境造成了巨大危害 在提倡高產(chǎn) 高 效 綠色農(nóng)業(yè)的大背景下 高效 復(fù)合型促生菌 的研究與應(yīng)用為尋求傳統(tǒng)化肥 農(nóng)藥替代產(chǎn)品以 及修復(fù)受損土壤環(huán)境指明了方向 根際促生菌 Plant Growth Promoting Rhizobacteria PGPR 泛指一類自由生長(zhǎng)在根際土壤環(huán)境中或根系內(nèi) 部 并具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)或增加作物產(chǎn)量 抑制 病蟲害能力的根際細(xì)菌 其對(duì)克服土壤逆境 改 善微生態(tài)環(huán)境具有特殊意義 1 目前為止 國(guó)內(nèi) 外已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的具有防病促生潛能的根際微生物有 20多個(gè)種屬 包括根瘤菌 沙雷氏屬 熒光假單 孢菌 芽孢桿菌等 2 上述根際促生菌對(duì)于植物 的促生機(jī)制主要包括合成對(duì)于植物生長(zhǎng)發(fā)育有直 接促進(jìn)作用的物質(zhì) 如吲哚乙酸 IAA 等植物激 素 改變?cè)匦螒B(tài)促進(jìn)植物對(duì)于養(yǎng)分的吸收等 如固氮 解磷 2 8 然而 大多數(shù)菌株在克服 養(yǎng)分 病害逆境時(shí)功能較為單一 因此 篩選獲 得具有復(fù)合能力的促生菌株 對(duì)高效改善根際營(yíng) 養(yǎng)與調(diào)控土壤微生態(tài)環(huán)境具有非常重要的意義 油菜 Brassica napus L 和黃瓜 Cucumis sativus L 均為我國(guó)大面積種植作物 特別是油 菜 因其花期之前可作菜用 花期之后籽?？烧?油而具有 油 菜兼顧 之特色 在我國(guó)蔬菜和 食用油領(lǐng)域占有重要地位 9 本研究以稻 油不 同輪作條件下的耕層土壤為樣本 擬通過選擇性 培養(yǎng)方法獲得兼具固氮 解磷以及產(chǎn)IAA 能力的 復(fù)合型高效促生菌株 并通 過 盆 栽 試 驗(yàn) 對(duì) 其 促 生 效果予以驗(yàn)證 本研究不僅能夠?yàn)槭卟朔N植養(yǎng)分培 育資源的更廣闊替代利用提供優(yōu)良促生菌株材料 還可以從可培養(yǎng)耕層土壤促生菌數(shù)量的角度揭示 稻 油輪作制度對(duì)地力生態(tài)功能維護(hù)的優(yōu)勢(shì) 1 材料和方法 1 1 試驗(yàn)材料 1 1 1 供試土壤與種子 土壤為稻 油輪作與稻 稻輪作耕層土壤 位于湖南瀏陽的農(nóng)大稻 油輪作試驗(yàn)田 油菜品種為常雜油菜3 號(hào) 購(gòu)于湖南省農(nóng)業(yè) 科學(xué)院湘科種苗集團(tuán) 黃瓜品種為蔬研十號(hào) 購(gòu) 于湖南興蔬種業(yè)有限公司 1 1 2 培養(yǎng)基 肉湯酵母培養(yǎng)基 NBY 營(yíng)養(yǎng)肉湯粉8 g 酵母提取物2 g 磷酸氫二鉀2 g 磷酸二氫鉀0 5 g 葡萄糖2 5 g 1 mol L七水合硫酸鎂1 mL 去離 子水1 L 瓊脂15 g pH值7 5 固氮培養(yǎng)基 阿須貝培養(yǎng)基 無N培養(yǎng)基 蘋果酸2 g 三水合磷酸氫二鉀0 5 g 七水合硫酸 鎂0 2 g 氯化鈉0 1 g 二水合氯化鈣20 mg 鉬酸 鈉2 mg 氫氧化鉀4 5 g 5 溴百里酚5 mL 維生 素H 10 mg 瓊脂15 g 去離子水1 L pH值7 5 解磷培養(yǎng)基 葡萄糖10 g 磷酸鈣5 g 六水合 氯化鎂5 g 七水合硫酸鎂0 25 g 氯化鉀0 2 g 硫 酸銨0 1 g 瓊脂15 g 去離子水1 L pH值7 0 液體LB 培養(yǎng)基 胰蛋白胨10 g 酵母提取物 5 g NaCl 10 g 去離子水950 mL pH值7 0 IAA 檢測(cè)培養(yǎng)基為胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基 胰蛋白胨17 g 植物蛋白胨3 g 氯化鈉5 g 磷酸氫 二鉀2 5 g 葡萄糖2 5 g 色氨酸100 g mL 最 終pH值7 3 0 2 1 2 試驗(yàn)方法 1 2 1 復(fù)合促生菌株篩選試驗(yàn) 土壤可培養(yǎng)細(xì)菌分離采用連續(xù)稀釋法 具 soil in rice rice rotation system 38 NFB strains and 35 PSB strains could be isolated from top soil in rice rape rotation system and 6 strains of compound type NFB PSB AB PGPR were isolated from top soil in two rotation systems which could promote the growth of plant height of rape and cucumber seedlings by 25 45 111 96 and 4 45 18 22 respectively In addition DD 69 and DY 111 had significant growth promoting effects on the cucumber root length DY 6 and DD 79 had significant growth promoting effects on the fresh quality of cucumber respectively Keywords plant growth promoting rhizobacteria rotation paddy soil strain screening rape cucumber 17 Vegetables 2020 6 試驗(yàn)研究 體步驟為 稱取10 g土壤于置有90 mL無菌水的 250 mL三角瓶中 振蕩搖勻30 min 180 r min 靜置5 min 分別吸取1 mL懸液加入置有9 mL 無菌水的滅菌試管中 后依次連續(xù)稀釋至10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 等不同濃度 吸取不同濃度 混合液100 L并涂布于NBY培養(yǎng)皿中 于25 條 件倒置培養(yǎng)于生化培養(yǎng)箱中 菌株純化 每隔12 h觀察上述培養(yǎng)皿生長(zhǎng)情 況 待菌落生長(zhǎng)至適合形態(tài)時(shí) 用接種棒挑取單 菌落劃線至NBY培養(yǎng)皿 25 條件倒置培養(yǎng)于生 化培養(yǎng)箱培養(yǎng) 備用 促生菌初篩 分別將純化后的菌株接種于固 氮 解磷培養(yǎng)基 室溫條件培養(yǎng) 每隔12 h觀察 菌株生長(zhǎng)情況 在2 種固氮培養(yǎng)皿上同時(shí)可以良 好生長(zhǎng)的菌株記為固氮菌 在解磷培養(yǎng)基上可觀 察到清澈透明圈的菌株記為解磷菌 所有記號(hào)菌 株均另劃線接種至新NBY 培養(yǎng)皿 編號(hào) 室溫培 養(yǎng)3 d 后轉(zhuǎn)至4 低溫保存 備用 促生菌復(fù)篩 將疑似菌株重復(fù)進(jìn)行固氮解磷 培養(yǎng)試驗(yàn) 以檢驗(yàn)效果是否準(zhǔn)確 同時(shí)將疑似固 氮解磷菌株分別接種至含有5 mL液體LB 培養(yǎng)基 的10 mL試管中 于170 r min 28 條件下振蕩 培養(yǎng)48 h 后加入Salkowsky生長(zhǎng)素顯色試劑 觀 察顯色反應(yīng) 確定其產(chǎn)IAA 能力強(qiáng)弱 如顯粉紅 色則為產(chǎn)生長(zhǎng)素菌株 記號(hào)并進(jìn)行生長(zhǎng)素定量檢 測(cè) IAA 定量檢測(cè) 10 接種于IAA 檢測(cè)培養(yǎng)基的各 生防菌株在24 150 r min條件下振蕩培養(yǎng)48 h 后 經(jīng)12 000 r min離心10 min 1 mL菌懸液加入 2 mL Salkowsky試劑并混勻 于28 培養(yǎng)30 min后 得到粉色顯色 并在530 nm條件下進(jìn)行比色 以 10 100 g mL的標(biāo)準(zhǔn)IAA稀釋液設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線 單位表示為 g mL 1 2 2 盆栽促生試驗(yàn) 采用人工氣候箱培育油菜和黃瓜幼苗 具體 步驟為 1 土壤 過2 mm篩風(fēng)干土 裝杯 2 供試促生菌經(jīng)純化后接種于100 mL NBY 液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)48 h 備用 3 將形態(tài) 一致的油菜種子 黃瓜種子分別于各菌株發(fā)酵液 中浸種10 min 后均勻播種于上述土杯中 每杯 5 粒 并將剩余菌液倒入各處理土壤 以清水 作為對(duì)照 4 培養(yǎng)于人工氣候箱中 培養(yǎng)條 件 28 光照16 h 16 無光8 h 試驗(yàn)設(shè)無菌對(duì)照處理和已篩選出的不同復(fù)合 菌株處理 各處理重復(fù)10杯 日常管理 10 d后 觀察記錄不同處理油菜 黃瓜幼苗植株鮮質(zhì)量 根長(zhǎng) 株高等生長(zhǎng)指標(biāo) 2 結(jié)果與分析 2 1 固氮 解磷菌株初篩結(jié)果 從表1 可以得出 篩選并純化處理后 最終 獲得稻 稻輪作土壤中可分離菌株194株 稻 油輪作土壤中可分離菌株208株 通過選擇性培養(yǎng)基專性生長(zhǎng)培養(yǎng)法 初步篩 選共獲得固氮菌73株 其中稻 稻輪作土壤獲得 35株 稻 油輪作土壤獲得38株 解磷菌38株 其中稻 稻輪作土壤獲得3 株 稻 油輪作土壤 獲得35株 表1 2 2 固氮 解磷菌株復(fù)篩驗(yàn)證 通過對(duì)比2 種不同種植制度中所獲解磷菌與 固氮菌編號(hào) 圖1 圖2 發(fā)現(xiàn) 同時(shí)兼具解磷 與固氮效果的復(fù)合菌株編號(hào)為 59 69 79號(hào) 稻 稻 6 7 14 107 110 111 112 號(hào) 稻 油 2 3 復(fù)合型固氮解磷菌產(chǎn)IAA能力定量檢測(cè) 通過對(duì)兼具固氮與解磷特性的復(fù)合菌株進(jìn) 行產(chǎn)IAA 能力定量檢測(cè)后發(fā)現(xiàn) DD 69 DD 79 D Y 6 D Y 7 DY 111 DY 112具有較強(qiáng)的 IAA 分泌能力 10 g mL 其濃度范圍為 10 09 12 59 g mL 表2 表1 固氮 解磷菌株篩選結(jié)果 土壤來源 可分離細(xì)菌 初篩 復(fù)篩 初篩解磷菌 初篩固氮菌 兼具固氮解磷菌 稻 稻輪作土壤 194 3 35 3 稻 油輪作土壤 208 35 38 7 株 18 Vegetables 2020 6 試驗(yàn)研究 2 4 盆栽促生實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 如表3 所示 與對(duì)照相比 篩選出的6 株復(fù) 合型促生菌對(duì)油菜和黃瓜幼苗早期株高的生 長(zhǎng)普遍具有顯著的促進(jìn)效果 其增幅分別為 25 45 111 96 和4 45 18 22 以DD 69最 佳 促生菌D Y 6 與D Y 7 菌株對(duì)油菜幼苗早期根系 生長(zhǎng)具有一定促進(jìn)效果 DD 79 DY 111 菌促生 效果均不顯著 促生菌DD 69與DY 111 對(duì)黃瓜幼 苗早期根系生長(zhǎng)具有一定促進(jìn)效果 且與CK 和其 他菌株差異顯著 促生菌對(duì)油菜幼苗早期鮮質(zhì)量 的影響差異不顯著 但促生菌D Y 6 和DD 79對(duì)黃 瓜幼苗早期鮮質(zhì)量具有顯著促生效果 3 結(jié)論與討論 本研究通過選擇性培養(yǎng)基分離等傳統(tǒng)微生物 技術(shù)對(duì)稻 稻輪作與稻 油輪作制度下耕層水 稻土壤中的促生細(xì)菌進(jìn)行了分離與篩選工作 結(jié)果表明稻 稻輪作耕層土壤中分離獲得194個(gè) 菌株 其中含固氮菌35株 解磷菌3 株 稻 油 輪作耕層土壤中分離獲得208個(gè)菌株 其中含固 氮菌38株 解磷菌35株 復(fù)合驗(yàn)證結(jié)果顯示 兼具固氮 解磷以及較強(qiáng)生長(zhǎng)素分泌能力的促 生菌株共6 株 分別為DD 69 DD 79 D Y 6 D Y 7 DY 111 DY 112 其IAA 分泌濃度為 10 09 12 59 g mL 經(jīng)人工氣候箱培育試驗(yàn)發(fā) 現(xiàn) 獲得的6 株復(fù)合型促生菌普遍對(duì)油菜和黃瓜 早期幼苗株高生長(zhǎng)具有一定的促生效果 尤其是 有利于幼苗株高的生長(zhǎng) 根際促生菌 PGPR 是一類根際環(huán)境友好 型微生物 具有改善土壤理化性質(zhì) 提高土壤 肥力 抑制病蟲害發(fā)生等重要農(nóng)業(yè)利用屬性 11 顏色越透明 解磷能力越強(qiáng) 圖1 解磷菌平板篩選結(jié)果 阿須貝培養(yǎng)基 無N 培養(yǎng)基 能夠同時(shí)在無氮培養(yǎng)基和阿須貝培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株為固氮菌 生長(zhǎng)越旺盛 固氮能力越強(qiáng) 圖2 固氮菌平板篩選結(jié)果 表2 產(chǎn)IAA能力檢測(cè)結(jié)果 部分菌株 IAA高產(chǎn)菌株編號(hào) 濃度 g mL DD 69 10 13 DD 79 10 09 DY 6 11 26 DY 7 10 58 DY 111 11 12 DY 112 12 59 19 Vegetables 2020 6 試驗(yàn)研究 對(duì)復(fù)合型高效促生菌的篩選是獲得這類有益微生 物的必然途徑 本研究以稻 稻 稻 油等不同 輪作制度的耕層水稻土壤為篩選材料 通過傳統(tǒng) 微生物分離技術(shù) 對(duì)其中的固氮菌 解磷菌以及 生長(zhǎng)素代謝菌等可培養(yǎng)功能細(xì)菌進(jìn)行了分離與篩 選 并經(jīng)復(fù)篩與盆栽試驗(yàn)對(duì)獲得的6 株復(fù)合型促 生菌株的促生效果予以了明確 這與前人 11 有關(guān) 固氮 解磷菌促進(jìn)作物生長(zhǎng)的試驗(yàn)結(jié)果一致 本 研究中6 株促生菌雖對(duì)油菜幼苗和黃瓜幼苗的早 期生長(zhǎng)具有一定促進(jìn)效果 但對(duì)根系的促生效果 普遍不夠顯著 DD 69和DY 111 除外 這可能 與接種劑量以及容重等土壤理化性狀有關(guān) 12 此 外 本研究結(jié)果還顯示出稻 油輪作制度下耕層 水稻土壤中的可分離細(xì)菌以及具有固氮 解磷 產(chǎn)IAA 能力促生菌可篩選數(shù)量明顯高于稻 稻輪 作制度的種植土壤 從根際有益微生物的角度佐 證了稻 油輪作制度對(duì)作物根際土壤生態(tài)環(huán)境的 積極作用 參考文獻(xiàn) 1 KLOEPPER J W SCHORTH M KLOEPPER J et al Plant growth promoting rhizobacteria in radishes C proceedings of the 4th international conference on plant pathogenic bacteria Tours Gilbert Clarey 1978 879 882 2 林凡 王正芳 宋末 等 聯(lián)合固氮菌的應(yīng)用效益與增產(chǎn) 機(jī)理 J 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào) 1998 14 3 32 34 3 劉淑琮 馮斷 于潔 植物根際促生菌的研究進(jìn)展及其環(huán) 境作用 J 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2009 48 11 2882 2287 4 田宏 張德罡 姚拓 土壤聯(lián)合固氮菌的研究進(jìn)展 J 草 原與草坪 2004 2 3 7 5 田婧 李邵 馬寧 等 植物根際促生菌作用機(jī)理研究進(jìn) 展 J 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016 44 10 1 2 39 6 GLICK B R The enhancement of plant growth by free living bacteria J Canadian Journal of Microbiology 1995 41 2 109 117 7 KASIM W A OSMAN M E OMAR M N et al Control of drought stress in wheat using plant growth promoting bacteria J Journal of Plant Growth Regulation 2013 32 1 122 130 8 RADHAKRISHNAN R SHIM K B LEE B W et al IAA producing Penicillium sp NICS01 triggers plant growth and suppresses Fusarium sp induced oxidative stress in sesame Sesamum indicum L J Journal of Microbiology Biotechnology 2013 23 856 863 9 謝慧 譚太龍 羅晴 等 油菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及面臨的機(jī) 遇 J 作物研究 2018 32 5 87 92 10 GLICKMANN E DESSAUX Y A critical examination of the specificity of the salkowski reagent for indolic compounds produced by phytopathogenic bacteria J Applied and Environmental Microbiology 1995 61 2 793 796 11 姚拓 蒲小鵬 張德罡 等 高寒地區(qū)燕麥根際聯(lián)合固氮 菌研究 固氮菌對(duì)燕麥生長(zhǎng)的影響及其固氮量測(cè)定 J 草業(yè)學(xué)報(bào) 2004 13 5 101 110 12 李麗麗 郎敬 楊洪一 等 大豆根際解磷細(xì)菌的分離及 篩選 J 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014 53 13 13 15 蔬 表3 促生菌對(duì)油菜 黃瓜幼苗生長(zhǎng)的促進(jìn)效果 處理 油菜幼苗 黃瓜幼苗 株高 cm 根長(zhǎng) cm 單株鮮質(zhì)量 g 株高 cm 根長(zhǎng) cm 單株鮮質(zhì)量 g CK 3 93d 1 53ab 0 13a 2 47c 1 39b 0 58b DD 69 8 33a 1 43ab 0 17a 2 92a 1 77a 0 70ab DD 79 6 17b 1 77ab 0 18a 2 73a 1 55b 0 72a DY 6 4 93c 2 57a 0 19a 2 64b 1 46b 0 79a DY 7 7 17ab 2 40a 0 24a 2 88a 1 48b 0 66b DY 111 7 27ab 1 80ab 0 20a 2 75a 1 84a 0 70ab DY 112 6 03b 1 13b 0 18a 2 58bc 1 57b 0 64b 注 同列不同小寫字母表示在0 05水平上差異顯著