百日菊白粉菌的分子檢測與鑒定.pdf

劉 閏 周 暄 邢 帥 等 百日菊白粉菊菌的分子檢測與鑒定 J 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020 48 6 98 103 doi 10 15889 j issn 1002 1302 2020 06 020 百日菊白粉菌的分子檢測與鑒定 劉 閏 周 暄 邢 帥 楊旭欣 王占斌 東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院 黑龍江哈爾濱 150040 摘要 對百日上的白粉菌進(jìn)行分子生物學(xué)分析 采用試劑盒法提取病原菌總基因組 DNA PCR 擴(kuò)增其 rDNA 內(nèi)轉(zhuǎn) 錄間隔區(qū) internal transcribed spacer 簡稱 ITS 的保守序列并測序 并通過 Clustal 與 MEAG 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹推演 系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系 在分子水平鑒定該菌種并比較與其他白粉菌菌種的親緣關(guān)系 結(jié)果表明 本研究測序的百日菊白粉菌 BC180623 的 ITS 序列與發(fā)生在土耳其菊芋上的 Erysiphe cichoracearum KF453969 1 相似度達(dá)到 99 與其具有比較 近的親緣關(guān)系 以百日菊白粉菌為研究對象 在分子水平鑒定該菌種并分析其進(jìn)化親緣關(guān)系為本試驗的創(chuàng)新之處 關(guān)鍵詞 百日菊 白粉菌 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) 序列分析 中圖分類號 S435 672 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1002 1302 2020 06 0098 06 收稿日期 2019 01 30 基金項 目 東北林業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃 編 號 201710225294 作者簡介 劉 閏 1998 女 內(nèi)蒙古赤峰人 碩士研究生 主要從 事植物病理學(xué)研究 E mail 1293365687 qq com 通信作者 王占斌 博士 副教授 主要從事分子植物病理學(xué)研究 E mail wangzbchina 163 com 百日菊 Zinnia elegans Jacq 別稱百日草 為中 藥材 以全草入藥 百日菊也是一年生草花主栽品 種之一 其色彩豐富 花大 艷麗 花期長達(dá)百日 故 得百日菊之美名 白粉病是百日菊常見的最重要 病害之一 在生長區(qū)幾乎每年都普遍發(fā)生 1 3 百 日菊被白粉菌侵染后 最初葉片出現(xiàn)白色粉狀斑 點 后病斑擴(kuò)大或相連成片 發(fā)病后期葉面布滿白 色粉層 葉片變褐 嚴(yán)重影響觀賞價值 甚至導(dǎo)致植 株成片死亡 發(fā)病后期在發(fā)病部位形成的小黑點 即為病菌的閉囊殼 據(jù)以前的研究報道有 2 個屬的 白粉菌引起百日菊的白粉病 分別是白粉菌屬 Erysiphe 和單絲殼屬 Sphaerotheca 屬于子囊菌 門 Ascomycota 白粉菌目 Erysiphales 白粉菌科 Erysiphaceae 4 7 白粉菌傳統(tǒng)的鑒定以其形態(tài)學(xué)為主要特征 如 有性世代閉囊殼內(nèi)子囊的個數(shù)及子囊孢子的數(shù)目 閉囊殼外附屬絲的特征等 但傳統(tǒng)的分類特征有諸 多不足之處 8 11 近年來 分子生物學(xué)在植物病害 鑒定上的應(yīng)用越來越廣泛 特別是植物病原菌在 rDNA 的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) internal transcribed spacer 簡稱 ITS 既具有保守性 又在科 屬 種水平上均有 特異性序列的特點 通過特異性引物對 ITS 區(qū)段進(jìn) 行 PCR 擴(kuò)增 可用于快速鑒定 檢測植物病原菌以 及病害的診斷等 12 13 目前國內(nèi)關(guān)于百日菊白粉 病病原菌分子分類系統(tǒng)的研究未見報道 通過提取 百日菊白粉菌總基因組 DNA 利用分子生物學(xué)技術(shù) 對其分類特征及進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行研究 可為該花卉白 粉病的準(zhǔn)確調(diào)查提供有效和實用的手段 1 材料與方法 1 1 試驗材料 白粉菌樣本于 2017 年 8 月 12 日采自黑龍江省 哈爾濱市東北林業(yè)大學(xué)城市實驗林場 樣品編號為 BC180623 寄主植物為百日菊 提取白粉菌基因組 DNA 的試劑盒購自盛澤生物試劑有限公司 目錄 號 DP321 1 2 試驗方法 1 2 1 樣品白粉菌的收集 刀片輕輕刮下葉片表 面的菌絲與閉囊殼混合物 放入 2 mL 離心管中 置 于 4 冰箱中保存 1 2 2 基因組 DNA 的提取 采用試劑盒法提取百 日菊白粉菌基因組 DNA 1 取適量白粉菌菌絲放 入研缽中 加入液氮充分研磨 2 加入 400 L 緩 沖液 FP1 和 6 LRNaseA 10 mg mL 渦旋振蕩 1 min 室溫放置 10 min 3 加入 130 L 緩沖液 FP2 充分混勻 渦旋振蕩 1 min 12 000 r min 離心 5 min 將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中 重復(fù)這一步 驟 4 向上清液中加入 0 7 倍體積的異丙醇 充分 混勻 此時出現(xiàn)絮狀基因組 DNA 離心 2 min 棄上 89 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020 年第 48 卷第 6 期 清 保留沉淀 5 加入 700 L 70 乙醇 渦旋振蕩 5 s 12 000 r min 離心 2 min 棄上清 重復(fù)這一步 驟 6 開蓋倒置 室溫晾干 10 min 徹底晾干殘余 的乙醇 7 加入適量洗脫緩沖液 TE 65 水浴 10 60 min 溶解 DNA 期間顛倒混勻數(shù)次助溶 最 終得到 DNA 溶液 用瓊脂糖凝膠電泳方法檢測得 到的 DNA 溶液 1 2 3 ITS 序列 PCR 擴(kuò)增 PCR 反應(yīng)的引物采用 通用引物 ITS1 ITS4 1 13 PCR 反應(yīng)所用的試劑是 PCR Mix 25 L 的反應(yīng)體系如下 模板 DNA 1 L PCR Mix 12 L ddH 2 O 10 L P1 和 P2 分別為 1 L PCR 擴(kuò)增條件 94 預(yù)變性 2 min 94 變 性 30 s 60 退火 30 s 72 延伸 2 min 30 次循環(huán) 72 最終延伸 10 min PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 0 8 瓊脂 糖凝膠電泳檢測 EB 染色觀察 檢測合格樣品進(jìn)行 序列測定與分析 1 2 5 序列分析 將所得 DNA 序列輸入 GenBank 進(jìn)行 BLAST 比對檢索 從 NCBI 數(shù)據(jù)庫中調(diào)取 22 種 白粉菌 ITS 保守序列 采用 Clustalx1 83 將測序白粉 菌 BC180623 結(jié)果與不同白粉菌的 ITS 序列構(gòu)建 系統(tǒng)發(fā)育樹 推演系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系 2 結(jié)果與分析 2 1 基因組 DNA 提取與 PCR 擴(kuò)增的結(jié)果 ITS 通用引物擴(kuò)增獲得的目的片段用膠回收試 劑盒回收并純化 對所得結(jié)果進(jìn)行電泳檢測 圖 1 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在回收后送生工生物工程 上海 股 份有限公司測序 測序獲得長度為 603 bp 的堿基序 列 結(jié)果如下 AGGACGTAGCTTGTGCTGCGTCGTG CATCGACCTCTCCACCCGTGTTGACTTTATCACTT GTTGCTTTGGCGGACCGGGCCGCGCACACGTCTGT GTGTGTTGGTCCGCTGGCTACGGCTGGAGCGCGT CTGCCAGAGACTTATAAACAACCTAACTCAAGTT TTACCTGCAGTCTAAGACAAGATTTATTAAGAAT TGATAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTG GCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGT AATGTGAATTGCAGAATTTAGTGAATCATCGAAT CTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGCATTCCGAG GGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATAACACCCCCCT CAAGTCACCGTTTGTGTGACTTCGGTGTTGGGGCT CGCCCACCTGGGTGGCCCTTAAAGACAGTGGCGG TACCGGCGTGAGCTCTACGCGTAGTAATCTGTATC TCGCGACAGAGCGCCGACGGTGGCTGGCCAAAAG CTCCTCCTTTGTAGATGTTTATCTACATCCAAGGT TGACCTCGAATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACT TAAGCATATCAATAGCCGGGAGGAAAA 2 3 百日菊白粉菌 ITS 序列進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果與 分析 獲得的序列用 NCBI 的 BLAST 進(jìn)行序列搜索 從 GenBank 中選取部分植物白粉菌 ITS 序列與本試 驗測序結(jié)果進(jìn)行比較分析 表 1 對表 1 白粉菌的 ITS 序列對比分析結(jié)果見圖 2 由圖 2 可知 樣品百日菌白粉菌 BC180623 的 ITS 序列與 KF453969 1 的 ITS 序列最為接近 相似 度達(dá)到 99 兩者序列差異性主要體現(xiàn)在第 2 4 19 560 581 585 位堿基上 說明樣品百日菊白粉 菌與 KF453969 1 具有較近的親緣關(guān)系 此外 23 種白粉菌 ITS 序列 219 374 bp 之間保留著較高的 一致性 因此 這些區(qū)段有可能起到了保障白粉菌 性狀穩(wěn)定遺傳的功能 對 23 種白粉菌用 MEGA 5 05 軟件分析處理 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 圖 3 結(jié)果表明 23 種白粉菌的 ITS 序列形成 3 個比較大的分支 本研究測序的百 日菊白粉菌 BC180623 的 ITS 序列與發(fā)生在土耳其 菊芋上的白粉菌 KF453969 1 英國大波斯菊上的 白粉菌 KY660959 1 日本蓼屬植物上的白粉菌 LC331790 1 的 ITS 距離最近 這說明本研究的白 粉菌菌種與它們具有比較近的親緣關(guān)系 從分子水 平證明了發(fā)生在本地百日菊上的白粉病是 Erysiphe cichoracearum 所引起的 3 討論 傳統(tǒng)對于白粉菌的分類方法過多地依據(jù)寄主 種類 危害癥狀與顯微鏡觀察對菌物不同的形態(tài)特 征進(jìn)行比較和分類 通過對大量標(biāo)本測量與數(shù)據(jù)的 99 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020 年第 48 卷第 6 期 表 1 用于同源性比較分析的白粉菌 序號 白粉菌種類 登錄號 寄主植物 備注 1 Erysiphe sp Synonyms Golovinomyces sp LC331790 1 蓼屬植物 日本 2 Erysiphe adunca KY660862 1 園林植物 英國 3 Erysiphe cichoracearum Synonyms Golovinomyces cichoracearum KY660959 1 大波斯菊 英國 4 Erysiphe cruciferarum KC878683 1 大白菜 中國 5 Erysiphe cruciferarum EU140958 1 油菜 意大利 6 Erysiphe pisi FJ378868 1 豌豆 美國 7 Erysiphe heraclei KF680162 1 歐芹 韓國 8 Erysiphe Pseudoidium sp AB522714 1 羅勒 印度 9 Erysiphe betae DQ164440 1 甜菜 英國 10 Erysiphe heraclei JN603995 1 蒔蘿 韓國 11 Erysiphe heraclei JX499184 1 皺葉酸模 南韓 12 Erysiphe heraclei KF111807 1 山蘿卜 韓國 13 Erysiphe pisi FJ378871 1 豌豆 美國 14 Erysiphe sp HQ012432 1 大葉楊 中國 15 Erysiphe diffusa AY739112 2 大豆 巴西 16 Erysiphe alphitoides EF672350 1 橡樹 法國 17 Erysiphe heraclei EU010381 1 長春藤 意大利 18 Erysiphe cichoracearum Synonyms Golovinomyces cichoracearum KF453969 1 菊芋 土耳其 19 Erysiphe cruciferarum KT957424 1 芥菜 中國 20 Erysiphe diffusa KM260363 1 紫藤 中國 21 Erysiphe sp KY290257 1 盒子草 韓國 22 Erysiphe sp MF577080 1 鱷梨 美國 23 Erysiphe sp BC180623 百日菊 中國 比對之后才能得出結(jié)論 這種方法不僅費力費時 經(jīng)常由于研究者的主觀因素導(dǎo)致片面甚至錯誤的 結(jié)論 許多白粉菌由于種所處環(huán)境條影響 在附屬 絲等細(xì)微特征上也具有差別 因此導(dǎo)致鑒定效率 準(zhǔn)確率比較低 14 15 PCR 技術(shù)是診斷植物病害的有效方法 它比起 傳統(tǒng)檢測方法具有高靈敏性 快速 準(zhǔn)確 簡便等優(yōu) 點 ITS 序列在不同真菌種內(nèi)保守性強 而種間存 在變異 根據(jù)這一特性用 ITS 研究真菌系統(tǒng)發(fā)育和 檢測已經(jīng)成為有效的成熟手段 16 19 郭徐鵬等通 過對白粉菌 ITS 區(qū) DNA 片段的提取擴(kuò)增和分析 對 陜西關(guān)中地區(qū)甘藍(lán)型油菜白粉病的病原菌進(jìn)行了 分子水平上的鑒定 20 文靜等通過對內(nèi)蒙古 4 種 白粉菌的 ITS 序列分析 構(gòu)建進(jìn)化發(fā)育樹 表明 ITS 序列可用于白粉菌屬內(nèi)和屬間的親緣關(guān)系和分類 分析 21 通過一對特異性引物 ITS ITS4 利用 PCR 擴(kuò)增 的方法 對發(fā)生在百日菊上的白粉菌 DNA 進(jìn)行擴(kuò)增 并測序 將所獲得的測序結(jié)果與已上傳的白粉菌菌 種進(jìn)行 BLAST 比對 從中篩選相似度接近或較高的 菌種數(shù)據(jù)建立系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖 發(fā)現(xiàn)引起該病害的 白粉菌屬于 Erysiphe 屬 研究結(jié)果為該病原菌的檢 測 分類與鑒定提供理論依據(jù) 對此類病害的監(jiān)測 具有重要意義 參考文獻(xiàn) 1 翟小杰 段顯德 何玉會 百日草白粉病病斑在葉片上的空間分 布型及抽樣研究技術(shù) J 中國植保導(dǎo)刊 2014 6 46 50 2 修立紅 百日草白粉病無性孢子生物學(xué)特性研究 J 農(nóng)業(yè)與技 術(shù) 2013 6 18 25 3 Braun U Taxonomic studies in the genus Erysiphe Generic delimitation and position in the system of the Erysiphaceae J Nova Hedwigia 1981 34 3 4 679 719 4 Braun U Takamatsu S Phylogeny of Erysiphe Microsphaera Uncinula Erysipheae and Cystotheca Podosphaera Sphaerotheca Cystotheceae inferred from rDNA ITS sequences some taxonomic consequences J Schlechtendalia 2000 4 1 33 5 Takamatsu S New taxonomic system and molecular phylogeny of the powdery mildew fungi J Plant Prot 2002 56 229 237 6 劉鐵志 內(nèi)蒙古白粉菌志 M 赤峰 內(nèi)蒙古科學(xué)技術(shù)出版社 2010 126 128 7 戴芳瀾 中國真菌總匯 M 北京 科學(xué)出版社 1979 137 139 001 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020 年第 48 卷第 6 期 101 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020 年第 48 卷第 6 期 201 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020 年第 48 卷第 6 期 8 劉淑艷 高 松 白粉菌屬級分類系統(tǒng)的討論 J 菌物學(xué)報 2006 25 1 152 159 9 Braun U The powdery mildews Erysiphales of Europe M Jena Germany Gustav Fischer Verlag 1995 1 337 10 Takamatsu S Limkaisang S Braun U Phylogenetic relationships and generic affinity of Uncinula septata inferred from nuclear rDNA sequences J Mycoscience 2005 46 1 9 16 11 陳鳳毛 真菌 ITS 區(qū)序列結(jié)構(gòu)及其應(yīng)用 J 林業(yè)科技開發(fā) 2007 21 2 5 7 12 Kiss L Takamatsu S Cunnington J H Molecular identification of Oidium neolycopersici as the causal agent of the recent tomato powdery mildew epidemics in North 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中國農(nóng)學(xué)通報 2013 29 24 187 192 21 文 靜 劉鐵志 趙 冰 內(nèi)蒙古 4 種白粉菌的 ITS 序列分析 J 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014 42 12 50 52 301 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020 年第 48 卷第 6 期