基于mtDNACOI基因的寧夏煙粉虱及溫室白粉虱分子鑒定.pdf

西 北 農(nóng) 業(yè) 學(xué) 報(bào) 網(wǎng)絡(luò)出版日期 網(wǎng)絡(luò)出版地址 基于 基因的寧夏煙粉虱及 溫室白粉虱分子鑒定 收稿日期 修回日期 基金項(xiàng)目 寧夏 十三五 重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重大項(xiàng)目 寧夏自然科學(xué)基金 國(guó)家自然科學(xué)基金 第一作者 宋鮮梅 女 碩士研究生 從事植物保護(hù)研究 通信作者 王新譜 男 博士 教授 從事昆蟲系統(tǒng)學(xué)與多樣性研究 李 敏 女 博士 副教授 從事昆蟲分子生物學(xué)研究 宋鮮梅 李 敏 何云川 賀海明 王新譜 寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院 銀川 太原師范學(xué)院 生物系 山西晉中 摘 要 基于線粒體 基因 對(duì)寧夏地區(qū)粉虱進(jìn)行分子鑒定 選取寧 夏 個(gè)粉虱地理種群的 個(gè)樣本作為試驗(yàn)材料 用 軟件對(duì) 基因序列進(jìn)行讀取 整合 對(duì)齊 比對(duì)處理 用軟件 中的 模型計(jì)算種內(nèi)與種間遺傳距離 并用鄰接法 法 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 用軟件 進(jìn)行遺傳多樣性的分析 用軟件 構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖 結(jié) 果顯示 個(gè)樣本中的 個(gè)為 型煙粉虱 個(gè)為溫室白粉虱 表明目前 型煙粉虱已經(jīng)傳入寧夏銀川市 石嘴山市 中衛(wèi)市等 亟需對(duì)其危害和擴(kuò)散進(jìn)行有效控制 關(guān)鍵詞 煙粉虱 溫室白粉虱 生物型 基因 分子鑒定 中圖分類號(hào) 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 文章編號(hào) 近年來(lái) 寧夏蔬菜種植面積達(dá) 萬(wàn) 占全區(qū)作物種植面積的 產(chǎn)值占種植業(yè)總 產(chǎn)值的 蔬菜產(chǎn)業(yè)已成為寧夏的優(yōu)勢(shì)特色 產(chǎn)業(yè) 是區(qū)域農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要支柱 在寧 夏蔬菜生產(chǎn)中番茄和黃瓜的種植面積較大 其中 番茄栽培以保護(hù)地栽培為主 可周年生產(chǎn) 目前 粉虱危害已成為阻礙番茄可持續(xù)安全生產(chǎn)的重要 生物災(zāi)害之一 煙粉虱 和溫 室白粉虱 是中國(guó)北 方地區(qū)最常見的兩種粉虱 均為番茄的重要害蟲 且在寧夏都有發(fā)生報(bào)道 隨著種植面積的增 加 品種的更替 目前寧夏粉虱害蟲的種類及煙粉 虱的生物型是否變化 亟需研究確定 進(jìn)而為該類 害蟲的綠色防控提供科學(xué)依據(jù) 鑒于粉虱類害蟲體型微小 形態(tài)相似 極易隨 蔬菜 花卉 水果及其種苗的貿(mào)易活動(dòng)遠(yuǎn)距離傳 播 且難 以 快 速 準(zhǔn) 確 識(shí) 別 本研究基于線粒體 基因?qū)幭母鞯販厥覂?nèi)粉虱類害蟲以及煙 粉虱生物型進(jìn)行分子鑒定 以期對(duì)粉虱類害蟲的 快速識(shí)別 監(jiān)測(cè) 防止入侵等提供依據(jù) 材料與方法 供試蟲源 年 月在寧夏銀川 永寧 賀蘭山 石嘴山 吳忠 中衛(wèi) 中寧 固原等地種植的番茄 黃瓜和豆角等寄主上采集到 個(gè)粉虱種群的 個(gè)樣品 采集點(diǎn)分布如圖 所示 將采集的粉虱 置于盛有無(wú)水乙醇的 離心管中 保存 備用 粉虱樣品的具體采集信息如表 所 示 基因組 提取 取單頭粉虱成蟲于 的離心管中 用 適量的 浸泡 次 每次 用通用型柱式基因組提取試劑盒 康為世 紀(jì) 進(jìn)行總 的提取 用 分 光光度計(jì)檢測(cè)粉虱基因組 質(zhì) 量 濃 度 以 值確定其是否被污染 提取的 保存 備用 圖 寧夏粉虱采集地分布圖 擴(kuò)增及電泳檢測(cè) 粉虱種類的鑒定 以 個(gè)粉虱樣品基因組為 模板 利用通用型引物 和 進(jìn)行 擴(kuò)增 目標(biāo)片段長(zhǎng)度約為 反應(yīng)體系為 其中 全式金 上下游引物 各 模板 左右 加 至 擴(kuò)增程序?yàn)?預(yù) 變 性 次 循 環(huán) 最 后 延 伸 煙粉虱生物型的鑒定 以其中的 個(gè)煙粉虱 基因組為模板 利用通用型引物 和 進(jìn)行 擴(kuò)增 目標(biāo)片段長(zhǎng)度約為 反應(yīng)體系同上 擴(kuò)增程序?yàn)?預(yù)變性 次循環(huán) 最后 延伸 引物均由上海 生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成 擴(kuò)增產(chǎn)物 于 保存 備用 擴(kuò)增結(jié)束后 取擴(kuò)增產(chǎn)物 用 的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳 選取與目標(biāo)片段長(zhǎng) 度一致的單一片段 產(chǎn)物送北京華大基因生 物技術(shù)有限公司測(cè)序 每個(gè)種群粉虱檢測(cè) 頭 共計(jì) 條序列 序列分析 用 軟件對(duì)公司返回的序列進(jìn)行 分析 根據(jù)序列峰圖分別刪除兩端引物序列以及 不穩(wěn)定和不準(zhǔn)確序列 以確保序列的高質(zhì)量 登陸 查閱并下載相關(guān)粉虱 基因片段序列 用軟件 對(duì)所測(cè)結(jié)果與 相關(guān)引用序列進(jìn)行比對(duì)分析 利用軟件中的 模型計(jì) 算種內(nèi)與種間遺傳距離 以獲得的寧夏地區(qū) 條 基因序列和巴西 煙粉虱 西班牙 煙粉 虱 塞 爾 維 亞 溫 室 白 粉 虱 登 錄 號(hào) 分 別 為 和 個(gè)地區(qū)粉 虱 基因序列為靶標(biāo) 黑刺粉虱 基因序列 為外 群 用軟件 中鄰接法 法 構(gòu)建系 統(tǒng)發(fā)育樹 以獲得的 條 型煙粉虱 基因 序列和在 下載的相關(guān)序列 序列命名 登錄 號(hào) 采集地 生物型 有的無(wú) 為靶標(biāo) 同樣以黑 刺粉 虱 基 因 序 列 為 外 群 構(gòu) 建 系 統(tǒng) 發(fā) 育 樹 系統(tǒng)發(fā)育樹分支的置信度采用自展法 重復(fù)檢測(cè) 次 用 軟件分析群體間的核苷酸多樣性 核酸平均差異度 單倍型多樣性 及 其相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)偏差 在 中構(gòu)建單倍 型網(wǎng)絡(luò)圖 結(jié)果與分析 單頭粉虱基因組質(zhì)量濃度 分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果顯示 所提取的單頭供 試粉虱基因組 為 所有基因組 質(zhì)量濃度均大于 滿足試驗(yàn)需要 擴(kuò)增 序列測(cè)定以及同源性分析 擴(kuò)增共計(jì)獲得 條序列 分別約 和 電泳檢測(cè)結(jié)果見圖 經(jīng)測(cè)序比對(duì) 并提交到 獲得基因序列登錄號(hào) 表 條 基因序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的靶標(biāo)種相 對(duì)應(yīng)的 基因片段的同源性均為 表明所獲得的 基因序列準(zhǔn)確可靠 所有煙粉虱序 列 比 對(duì) 序 列 和 與其他序列相比有 個(gè)堿 基的區(qū)別 分別是第 位的 和第 位 的 同樣所有溫室白粉虱序列相比 序列 與其他序列相比有 個(gè)堿基 的區(qū)別是第 位的 結(jié)果顯示 寧夏銀川 期 宋鮮梅等 基于 基因的寧夏煙粉虱及溫室白粉虱分子鑒定 市西夏區(qū) 中衛(wèi)市沙坡頭區(qū)和中寧縣的粉虱為 型煙粉虱 固原市原州區(qū) 吳忠市利通區(qū) 銀川市 永寧縣和賀蘭縣等地均為溫室白粉虱 而石嘴山 市大武口區(qū)既有 型煙粉虱又有溫室白粉虱 所測(cè) 型煙粉虱與 已知 型煙粉虱 基因序列對(duì)齊處理 比對(duì)長(zhǎng)度為 得 知寧夏 型煙粉虱 序列完全一致 序列中堿 基 的數(shù)量分別為 和 的含量為 型煙粉虱以及外群 黑刺粉虱 部分序列比對(duì)見圖 列 出序列以外的其他序列同 可以看出寧夏乃至中國(guó)與地中海周圍國(guó)家意大 利 摩洛哥 塞浦路斯等 型煙粉虱 序列有 個(gè)堿基之差 與地中海東部國(guó)家伊拉克 伊 朗 阿拉伯酋長(zhǎng)國(guó)等相差 個(gè)堿基 與美洲 一些國(guó)家相差大于 個(gè)堿基 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 圖 引物 對(duì) 個(gè)粉虱 基因序列的擴(kuò)增電泳檢測(cè)圖 型煙粉虱和溫室白粉虱的種內(nèi)與種間遺 傳距離 基于 基因序列 用軟件 中的 模型計(jì)算種內(nèi)與種 間遺傳距離 結(jié)果顯示 型煙粉虱和溫室白粉 虱種內(nèi)遺傳距離均為 種內(nèi)平均遺傳 距離均為 種間遺傳距離為 種 間遺傳距離為種內(nèi)遺傳距離的 倍 型煙粉虱和溫室白粉虱的系統(tǒng)發(fā)育樹分析 用于粉虱種類鑒定的 條 基因序列和 上已知且具代表性的 條 基因序列所 構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖 聚類分析結(jié)果表明 煙粉虱和溫室白粉虱明顯形成獨(dú)立的進(jìn)化分支 由所測(cè) 條 型煙粉虱 基因序列和在 下載的相關(guān)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹 圖 可以 看出 煙粉虱 基因序列首先與黑刺粉虱 基因序列分開 被測(cè)樣本序列與 等 條 已知 型煙粉虱序列聚為一支 相 似 度 為 和 聚 為 一 支 相 似 度 為 和 聚為一支 相似度為 和 聚為 一支 相 似 度 為 等 聚 為 一 支 相 似 度 為 被測(cè)樣序列與 所在 這一 支 序 列 相 似 度 為 與 所在這一支序列相似度為 與 所在這 一支序列相似度為 與 所在這一支序列相似度為 西 北 農(nóng) 業(yè) 學(xué) 報(bào) 卷 圖 型煙粉虱 序列比對(duì) 期 宋鮮梅等 基于 基因的寧夏煙粉虱及溫室白粉虱分子鑒定 書書書 表 用 于 序 列 分 析 的 粉 虱 的 具 體 采 集 信 息 以 及 登 錄 號(hào) 編 號(hào) 采 集 地 寄 主 植 物 采 集 日 期 采 集 人 測(cè) 序 樣 本 數(shù) 序 列 登 錄 號(hào) 銀 川 市 西 夏 區(qū) 軍 馬 場(chǎng) 番 茄 宋 鮮 梅 固 原 市 三 營(yíng) 鎮(zhèn) 利 民 村 番 茄 宋 鮮 梅 中 衛(wèi) 市 陽(yáng) 光 怡 然 生 態(tài) 園 番 茄 宋 鮮 梅 中 衛(wèi) 市 東 園 鎮(zhèn) 史 湖 村 黃 瓜 宋 鮮 梅 中 衛(wèi) 市 東 園 鎮(zhèn) 宋 家 莊 番 茄 宋 鮮 梅 中 衛(wèi) 市 柔 遠(yuǎn) 鎮(zhèn) 章 家 閘 番 茄 宋 鮮 梅 中 衛(wèi) 市 柔 遠(yuǎn) 鎮(zhèn) 柔 遠(yuǎn) 村 番 茄 宋 鮮 梅 中 衛(wèi) 市 中 寧 縣 莫 嘴 村 番 茄 宋 鮮 梅 吳 忠 市 利 通 區(qū) 龍 二 村 番 茄 宋 鮮 梅 永 寧 縣 永 清 村 豆 角 宋 鮮 梅 永 寧 縣 北 全 村 番 茄 宋 鮮 梅 賀 蘭 山 縣 產(chǎn) 業(yè) 園 區(qū) 番 茄 宋 鮮 梅 賀 蘭 山 縣 新 平 村 番 茄 宋 鮮 梅 石 嘴 山 市 大 武 口 區(qū) 簡(jiǎn) 泉 村 番 茄 宋 鮮 梅 西 北 農(nóng) 業(yè) 學(xué) 報(bào) 卷 圖 鄰接法構(gòu)建的粉虱基于 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹 遺傳多樣性和單倍型網(wǎng)絡(luò)圖分析 分析的 條序列共定義 個(gè)單倍型 表 分別命名為 單倍型的多樣 性為 單倍型 共享個(gè)體數(shù)最多 占 總個(gè)體數(shù)的 被 個(gè)及 個(gè)以上種群共享 的單倍型有 和 總?cè)后w的 為 為 和 的 標(biāo)準(zhǔn)差分別為 和 中性檢驗(yàn)結(jié)果 顯示 總種群的 可推斷 型煙粉虱近段歷 史時(shí)期發(fā)生過(guò)種群擴(kuò)張 用 構(gòu)建 單倍型網(wǎng)絡(luò)圖 圖 在所有樣本中較高頻率單 倍型位于圖的左上 其余獨(dú)立的單倍型則通過(guò)短 支與這幾種高頻率的單倍型相連 從地中海地區(qū) 逐漸到地中海東部 圖右上 亞洲一些國(guó)家 圖左 下 或美洲國(guó)家 圖右下 呈現(xiàn)從高向低頻率擴(kuò)散 出現(xiàn)明顯的進(jìn)化分支 結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育樹相吻合 說(shuō) 明 型煙粉虱存在種群變異 期 宋鮮梅等 基于 基因的寧夏煙粉虱及溫室白粉虱分子鑒定 圖 鄰接法構(gòu)建的 型煙粉虱基于 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹 表 型煙粉虱單倍型間的共享情況 單倍型 樣本數(shù)目 樣本編號(hào) 西 北 農(nóng) 業(yè) 學(xué) 報(bào) 卷 圖 型煙粉虱 基因單倍型網(wǎng)絡(luò)中介圖 討 論 本研究以寧夏 個(gè)不同地區(qū)種群的粉虱為 試驗(yàn)材料 采用通用引物 和 擴(kuò)增 基因序列 分子 鑒定結(jié)果表明 在寧夏銀川市西夏區(qū) 中衛(wèi)市沙坡 頭區(qū) 中寧縣 石嘴山市大武口區(qū)均有 型煙粉 虱的分布 在銀川市永寧縣和賀蘭縣 石嘴山市大 武口區(qū) 固原市原州區(qū) 吳忠市利通區(qū) 有溫室白 粉虱的分布 以上地區(qū)是寧夏蔬菜產(chǎn)業(yè)較發(fā)達(dá)的 區(qū)域 除中國(guó)北方普遍發(fā)生的溫室白粉虱外 本 研究明確了 型煙粉虱在寧夏的分布情況 而近 年來(lái)寧夏番茄種植區(qū)不斷加重的番茄黃化曲葉病 毒 病也從側(cè)面印證了 型煙粉虱的存 在 寧夏的 個(gè)地市中 固原市因海拔較高 氣候 冷涼 夏季溫度較低 屬冷涼蔬菜種植區(qū) 該區(qū)域 只有溫室白粉虱分布 尚未發(fā)現(xiàn) 型煙粉虱 究 其原因可能與 型煙粉虱起源于熱帶地區(qū) 冷涼 地區(qū)不適宜生存 寧夏的其他 個(gè)地市 夏季干 燥且溫度較高 蔬菜種植面積大 露地與保護(hù)地栽 培方式并存 且大量種植的茄果類和瓜菜類蔬菜 為煙粉虱提供了良好的寄主環(huán)境 利于煙粉虱的 生存繁殖 序列比對(duì)分析結(jié)果表明 寧夏不同地區(qū)的溫 室白粉虱和 型煙粉虱種內(nèi)遺傳分化現(xiàn)象不明 顯 未形成明顯的地理種群 通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育樹和 單倍型網(wǎng)絡(luò)圖可以看出 寧夏乃至中國(guó)與地中海 周圍的摩洛哥 突尼斯 埃及 西班牙 希臘 意大 利亞等國(guó)和非地中海地區(qū)的日本 越南 韓國(guó) 加 拿大 危地馬拉等國(guó)的 型煙粉虱聚為一支或共 享一個(gè)單倍型 寧夏 型煙粉虱所在這一支很有 可能是地中海的本土種群 與地中海東部的以色 列 塞浦路斯 土耳其 敘利亞共和國(guó)等國(guó)的 型 煙粉虱相似度高達(dá) 與伊拉克 伊朗 阿拉伯聯(lián)合酋長(zhǎng)國(guó) 巴基斯坦相似度達(dá) 而與美洲國(guó)家的相似度低 本研 究結(jié)果與滕希 關(guān)于 型煙粉虱在中國(guó)的發(fā)生 現(xiàn)狀及其基于 序列的系統(tǒng)發(fā)育分析 一 文中論述的中國(guó) 型煙粉虱的來(lái)源相一致 馬紹國(guó)等 報(bào)道在寧夏石嘴山市惠農(nóng)區(qū)發(fā)現(xiàn) 型煙粉虱 而本研究中在相同地區(qū)采集的煙粉 虱為 型煙粉虱 未檢測(cè)到 型煙粉虱 且最近 期 宋鮮梅等 基于 基因的寧夏煙粉虱及溫室白粉虱分子鑒定 研究 已表明中國(guó)農(nóng)區(qū)煙粉虱優(yōu)勢(shì)生物型已經(jīng) 由 型轉(zhuǎn)為 型 這可能與兩種不同生物型煙粉 虱的競(jìng)爭(zhēng)替代有關(guān) 很多研究表明 型煙粉虱 比 型煙粉虱有更強(qiáng)的生存優(yōu)勢(shì) 如 型煙粉虱 發(fā)育歷期比 型煙粉虱短 在低溫和高溫的條件 下都表現(xiàn)出更強(qiáng)的生存能力 而且 型粉虱擁有 更強(qiáng) 更廣泛 更穩(wěn)定的抗性 二者混合發(fā)生 時(shí) 經(jīng)過(guò)一定的時(shí)間 型煙粉虱會(huì)逐漸成為優(yōu)勢(shì) 生物型 結(jié) 論 本研究表明 寧夏銀川市西夏區(qū) 中衛(wèi)市沙坡 頭區(qū)和中寧縣的粉虱為 型煙粉虱 固原市原州 區(qū) 吳忠市利通區(qū) 銀川市永寧縣和賀蘭縣等地均 為溫室白粉虱 而石嘴山市大武口區(qū)既有 型煙 粉虱又有溫室白粉虱 同時(shí)發(fā)現(xiàn)寧夏 型煙粉 虱應(yīng)源于地中海本土種群 本研究結(jié)果可對(duì)不同 地區(qū)粉虱的針對(duì)性防控提供依據(jù) 參考文獻(xiàn) 黃亞玲 李曉瑞 溫淑萍 等 寧夏蔬菜產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)效率的實(shí)證 分析 寧夏農(nóng)林科技 張友軍 朱國(guó)仁 褚 棟 等 我國(guó)蔬菜作物重大入侵害蟲發(fā) 生 危害與控制 植物保護(hù) 馬紹國(guó) 哈金華 朱建祥 等 寧夏地區(qū)煙粉虱生活習(xí)性及發(fā) 生規(guī)律研究 寧夏農(nóng)林科技 顧沛雯 覃 強(qiáng) 王 萍 等 寧夏設(shè)施園藝病蟲害發(fā)生特 點(diǎn) 發(fā)展趨勢(shì)及綠色防治技術(shù) 農(nóng)業(yè)科學(xué)研究 滕 希 型煙粉風(fēng)在屮國(guó)的發(fā)生現(xiàn)狀及其基于 序 列的系統(tǒng)發(fā)育分析 北京 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 褚 棟 張友軍 近 年我國(guó)煙粉虱發(fā)生為害及防治研究 進(jìn)展 植物保護(hù) 劉 晨 張偉兵 洪 波 等 陜西菜田 種粉虱數(shù)量結(jié)構(gòu) 及煙粉虱生物型鑒定 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) 西 北 農(nóng) 業(yè) 學(xué) 報(bào) 卷 責(zé)任編輯 郭柏壽 期 宋鮮梅等 基于 基因的寧夏煙粉虱及溫室白粉虱分子鑒定