森林草莓醇酰基轉(zhuǎn)移酶基因FvAATW2功能研究.pdf
<p>園藝學(xué)報， 2018， 45 (1)： 41 50. Acta Horticulturae Sinica doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0085； http： /www. ahs. ac. cn 41 收稿日期 ： 2017 06 04； 修回日期 ： 2017 12 29 基金項目 ： 國家自然科學(xué)基金項目（ 31601714） ；北京市糧經(jīng)作物產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊項目（ BAIC09-2018） * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail： zhytao1963126.com） 森林草莓醇?；D(zhuǎn)移酶基因 FvAATW2 功能研究 董 靜，王桂霞，鐘傳飛，常琳琳，孫 健，張宏力，孫 瑞，石 琨，隗永青，張運濤*（北京市林業(yè)果樹科學(xué)研究院，北京市草莓工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，北京 100093） 摘 要： 在從森林草莓（ Fragaria vesca L.）成熟果實中克隆到醇酰基轉(zhuǎn)移酶基因（ FvAATW2）的基礎(chǔ)上， 構(gòu)建由 CaMV35S 啟動子驅(qū)動的植物正義表達(dá)載體 pBI121-FvAATW2， 在煙草 （ Nicotiana tabacum L.）和草莓（ Fragaria × ananassa Duch.） Camarosa品種中過量表達(dá) FvAATW2，以研究其功能。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草和草莓；利用 PCR 和 Southern blot 篩選出轉(zhuǎn)基因株系；通過實時定量 PCR 和測定 AAT 酶活性來檢測轉(zhuǎn)基因植株中外源基因的表達(dá)；利用 SPME/GC MS 方法檢測煙草葉片和草莓果實中的揮發(fā)性成分。對轉(zhuǎn)基因煙草外源基因表達(dá)和早期葉片揮發(fā)性成分的檢測結(jié)果表明，構(gòu)建的 FvAATW2表達(dá)載體功能正常，轉(zhuǎn)基因株系能夠在生長早期合成酯類物質(zhì)；通過檢測轉(zhuǎn)基因草莓成熟果實的酯類成分發(fā)現(xiàn)，與野生型對照相比，轉(zhuǎn)基因草莓果實中酯類占揮發(fā)物的總比例以及乙酸辛酯、己酸乙酯、己酸辛酯、辛酸乙酯等揮發(fā)酯的比例顯著提高，而丁酸甲酯的含量顯著降低，辛酸乙酯的含量顯著增加，說明外源 FvAATW2 在草莓中能夠正常表達(dá)并影響果實酯類合成，從而通過改變揮發(fā)性酯類構(gòu)成使果實香氣變濃。 關(guān)鍵詞： 森林草莓；醇酰基轉(zhuǎn)移酶；遺傳轉(zhuǎn)化；揮發(fā)性成分檢測；實時定量 PCR 中圖分類號： S 668.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號： 0513-353X（ 2018） 01-0041-10 Studying Function of Alcohol Acyltransferase Gene FvAATW2 of Fragaria vesca by Over-expressing in Tobacco and Cultivated Strawberry DONG Jing， WANG Guixia， ZHONG Chuanfei， CHANG Linlin， SUN Jian， ZHANG Hongli， SUN Rui，SHI Kun， WEI Yongqing， and ZHANG Yuntao*（ Beijing Academy of Forestry and Pomology Sciences； Beijing Engineering Research Center for Strawberry； Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops（ North China） ， Ministry of Agriculture， P. R . Chi na，Beijing 100093， China） Abstract： FvAATW2 was an alcohol acyltransferase gene， cloned from Fragaria vesca L. fruits by RT-PCR. In this study， the sense plant expression vector pBI121-FvAATW2 driven by cauliflower mosaic virus 35S promoter was constructed through replacing GUS with FvAATW2， and then was used to genetically transform tobacco and a cultivated strawberry cultivar Camarosa ， to study the function of FvAATW2. Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 carrying pBI121-FvAATW2 was employed to Dong Jing， Wang Guixia， Zhong Chuanfei， Chang Linlin， Sun Jian， Zhang Hongli， Sun Rui， Shi Kun， Wei Yongqing， Zhang Yuntao. Studying function of alcohol acyltransferase gene fvaatw2 of Fragaria vesca by over-expressing in tobacco and cultivated strawberry. 42 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (1)： 41 50. infect leaf-discs in the genetic transformation. Transgenic lines were identified by both PCR and Southern blot. The expression of exogenous FvAATW2 in transgenic in vitro plants was studied using relative enzyme activity and real-time quantitative PCR. It was found that FvAATW2 expressed in all 6 tested tobacco lines and AAT activity values of 5 lines were higher than wild-type plants. Volatiles in leaves of the transgenic tobacco with the highest AAT activity were also detected by SPME/GC-MS at 10 12 leaves phase. Octyl propanoate was found in transgenic leaves， while not any ester captured in wild-type plants at the same phase. The results showed that pBI121-FvAATW2 functioned correctly and esters could be synthesized much earlier in transgenic tobacco than in wild-type one. Four strawberry transgenic lines were obtained after PCR and Southern blot operation. A transgenic line bearing more aromatic fruits was screened out and used for the volatiles detection. Through analyzing the ester composition of mature transgenic fruits， it was found that the proportion of esters in total volatiles and respective proportions of octyl acetate， ethyl hexanoate， octyl hexanoate， and ethyl octanoate were higher significantly than those of wild-type fruits， while mass fraction of methyl butanoate decreased significantly and that of ethyl octanoate increased significantly. It was indicated that exogenous FvAATW2 expressed normally in cultivated strawberry and effected ester synthesis， and it could make fruit aroma intense by changing ester composition. Keywords： Fragaria vesca； alcohol acyltransferase； genetic transformation； volatile detection；real-time qPCR 酯類物質(zhì)在草莓香氣中起重要作用（ Larsen Antalick et al.， 2010） 丁酸甲酯 Methyl butanoate 2.67 ± 1.07 0.35 ± 0.35 1.26 ± 0.14*0.14 ± 0.14 果味，甜味，菠蘿味，青味 Fruity， sweetish， pineapple，green（ Ulrich et al.， 2007； Olbricht et al.， 2008） 丁酸乙酯 Ethyl butanoate 0.64 ± 0.38 1.08 ± 0.26 0.57 ± 0.52 0.57 ± 0.28 成熟獼猴桃味，甜味，菠蘿味 Ripe kiwi， sweet， pineapple（ Olbricht et al.， 2008； Antalick， 2010） 丁酸己酯 Hexyl butanoate 0.77 ± 0.18 1.15 ± 0.44 0.55 ± 0.21 0.69 ± 0.10 果味，杏子味 Fruity， apricot（ Dong et al.， 2013） 丁酸辛酯 Octyl butanoate 0.27 ± 0.27 2.58 ± 1.16 0.05 ± 0.05 0.15 ± 0.05 青草味，橙子，歐芹，甜瓜味 Herbaceous， orange， parsley， melon（謝劍平， 2009） 2甲基丁酸辛酯 Octyl-2methylbutanoate 0.70 ± 0.35 2.00 ± 0.79 0.09 ± 0.06 0.12 ± 0.03 3甲基丁酸辛酯 Octyl 3-methylbutanoate 1.05 ± 0.34 2.45 ± 1.05 0.09 ± 0.04 0.14 ± 0.05 己酸甲酯 Methyl hexanoate 4.09 ± 1.29 4.79 ± 1.53 3.10 ± 1.05 4.47 ± 0.67 果味，甜味，菠蘿味 Fruity， sweetish， pineapple （ Ulrich et al.， 2007； Olbricht et al.， 2008） 己酸乙酯 Ethyl hexanoate 2.62 ± 0.23 9.48 ± 3.61*2.92 ± 1.74 7.46 ± 0.90 果味，菠蘿味，葡萄酒香氣 Fruity， pineapple， winy （ Sarrazin et al.， 2007； Olbricht et al.， 2008） 己酸辛酯 Octyl hexanoate 0.08 ± 0.08 0.78 ± 0.78*0.02 ± 0.02 0.05 ± 0.05 辛酸甲酯 Methyl octanoate 0.35 ± 0.23 0.77 ± 0.31 0.40 ± 0.23 0.64 ± 0.15 葡萄酒香氣，果味，橙子 Winy， fruity， orange（謝劍平，2009； Antalick， 2010） 辛酸乙酯 Ethyl octanoate 0.00 ± 0.00 1.35 ± 0.75* 0.67 ± 0.33*果味，花香味，葡萄酒杏子味 Fruity， floral， wine apricot（ Noguerol-Pato et al.， 2009；謝劍平， 2009） 總計 Total 14.48 ± 0.43 65.73 ± 4.9*28.49 ± 10.49 39.00 ± 2.75 注： * 表示與野生型對照在 5%水平上差異顯著； *在 1%水平上差異顯著。 “”未檢出。 Note： * Means the difference was significant at 5% level compared with wild type control； * The difference was significant at 1%.“” Not detected. 3 討論 采用遺傳轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行揮發(fā)性成分代謝相關(guān)基因的功能研究時，常常需要考慮供轉(zhuǎn)化植株體內(nèi)是否含有可供利用的底物、底物與基因表達(dá)生成的酶在細(xì)胞內(nèi)的分布區(qū)域是否一致、生成的產(chǎn)物是否具有揮發(fā)性等因素。已報道過的用于香氣基因轉(zhuǎn)化的試材主要包括矮牽牛、煙草和番茄等，結(jié)果也不盡相同。 Lucker 等（ 2001）將 Clarkia breweri 的 S-檸檬烯合成基因 lis 在矮牽牛中過量表達(dá)，雖然轉(zhuǎn)基因植株顯著增加了非揮發(fā)性芳樟醇的積累，但并沒有將其轉(zhuǎn)變?yōu)閾]發(fā)性芳樟醇。 Guterman等（ 2006）在矮牽牛中過量表達(dá)玫瑰醇乙?；D(zhuǎn)移酶基因 RhAAT，使轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生了 2 種新酯：乙酸苯乙酯和乙酸苯甲酯，并改變了其香氣。 Beekwilder 等（ 2004）也嘗試?yán)貌葺?SAAT 轉(zhuǎn)化矮牽牛，卻沒有成功，不僅轉(zhuǎn)基因植株中沒有檢測到新酯類物質(zhì)，而原有的苯甲酸苯甲酯含量也沒有得到提高，通過葉片飼喂外源醇發(fā)現(xiàn)，這可能是由于矮牽牛體內(nèi)不存在 SAAT 可利用的醇類底物或底物含量少造成的。而李大鵬（ 2005）利用蘋果 MdAAT2 轉(zhuǎn)化煙草，進(jìn)行過量表達(dá)，引起轉(zhuǎn)基因植株葉片中的揮發(fā)性酯類構(gòu)成發(fā)生變化，既增加了已有酯的含量水平，又生成了新的酯類，但在番茄中進(jìn)行 MdAAT2 果實特異性表達(dá)時卻沒有檢測到酯類的變化，經(jīng)推測這可能是因為生成的 MdAAT2董 靜，王桂霞，鐘傳飛，常琳琳，孫 健，張宏力，孫 瑞，石 琨，隗永青，張運濤 . 森林草莓醇酰基轉(zhuǎn)移酶基因 FvAATW2 功能研究 . 園藝學(xué)報， 2018， 45 (1)： 41 50. 49 酶與底物在細(xì)胞內(nèi)分布于不同的區(qū)域造成的。 本研究中借鑒以上研究結(jié)果，采用過量表達(dá)的方式，利用煙草和草莓栽培品種開展野生森林草莓 FvAATW2 的功能研究，結(jié)果證明，這兩種供試材料用于 AAT 功能研究各有優(yōu)勢。煙草葉片中存在可供草莓 AAT 酶催化合成酯類所需的底物，和草莓遺傳轉(zhuǎn)化相比，轉(zhuǎn)化煙草周期較短，也更容易進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作，即使在植株生長早期（ 10 12 葉） ，也能在轉(zhuǎn)基因葉片中檢測到新生成的酯，這有利于加快基因功能研究的進(jìn)程；而利用近緣種來研究基因功能，能提供與原生種更接近的體內(nèi)代謝環(huán)境，由于用于檢測的也是成熟果實，這使得研究結(jié)果更具有說服力，另外，還有助于篩選合適的研究對象用于后續(xù)研究。 草莓的香氣與酯類構(gòu)成有關(guān) （ Dong et al.， 2013） 。 有研究者利用 RNAi 技術(shù)下調(diào)了 Royal Gala蘋果 AAT1 表達(dá)，使轉(zhuǎn)基因株系成熟果實的酯類總含量顯著下降，香氣明顯減弱（ Souleyre et al.，2014）。本研究中，在相同的栽培條件下，轉(zhuǎn)入 FvAATW2 使草莓栽培品種 Camarosa果實的酯類構(gòu)成發(fā)生了改變，新生成辛酸乙酯，已有的 4 種酯比例或 /和含量提高，而另外 1 種酯則下降；轉(zhuǎn)基因果實中比例和含量提高幅度較大的有乙酸辛酯、己酸乙酯、己酸辛酯、辛酸乙酯等，這些酯類成分多數(shù)都具有令人愉快的花香味和果香味，它們在總揮發(fā)物中所占比例的提高，可能是轉(zhuǎn)基因果實香氣變濃的一個重要原因。 References Antalick G， Perello M， Revel G. 2010. 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