葡萄傷流液中內(nèi)生菌分離鑒定與抗病功能分析.pdf

資源ID：5119 資源大?。?span id="i1gy61u" class="font-tahoma">3.60MB 全文頁(yè)數(shù)：15頁(yè)
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葡萄傷流液中內(nèi)生菌分離鑒定與抗病功能分析.pdf

<p>園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (11)： 2106 2120. Acta Horticulturae Sinica   2106                                                 doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2018-0125； http： /www. ahs. ac. cn 收稿日期： 2018 07 08；修回日期： 2018 10 30 基金項(xiàng)目：中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（ KYZ201736）；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目（ CARS-29-yc-1）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（ 31672131）；江蘇省自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（ BK20140708）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新項(xiàng)目 CX（ 18） 2008 * 通信作者  Author for correspondence（ E-mail： jiahaifengnjau.edu.cn， fanggg njau.edu.cn）  葡萄傷流液中內(nèi)生菌分離鑒定與抗病功能分析  鄭  婷，張培安，張克坤，糾松濤，朱旭東，宋長(zhǎng)年，賈海鋒*，房經(jīng)貴*（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇省果樹(shù)品種改良與種苗繁育工程中心，南京  210095）  摘  要：為探究葡萄樹(shù)液中內(nèi)生菌的種類(lèi)，對(duì)白羅莎里奧葡萄傷流液中的內(nèi)生菌進(jìn)行分離純化，得到 4 株普遍存在的有益菌株，根據(jù)形態(tài)特征、生理生化特性及 16S rDNA 序列同源性對(duì)其進(jìn)行鑒定，并針對(duì)葡萄灰霉病病原菌進(jìn)行抑菌測(cè)試。結(jié)果表明， 4 種內(nèi)生菌分別為粘紅酵母菌、隱球菌、水拉恩式菌、變形斑沙雷菌；平板抑菌試驗(yàn)顯示，隱球菌、水拉恩式菌、變形斑沙雷菌均對(duì)灰霉病菌有一定的拮抗作用。對(duì)葡萄果粒的病菌侵染試驗(yàn)表明，隱球菌、水拉恩式菌、變形斑沙雷菌均能使果粒失水速率降低、灰霉病病斑縮小，抗菌物質(zhì)類(lèi)黃酮、總酚以及 SOD、 CAT、 POD、 PPO 活性升高，灰霉病抗病相關(guān)基因VvHSF 和 VvDR 下調(diào)， VvPR17、 VvDW、 VvChi 和 VvWRKY 上調(diào)，且上調(diào)程度與抗病能力呈正相關(guān)，進(jìn)一步表明了隱球菌、水拉恩式菌、變形斑沙雷菌對(duì)灰霉病菌有一定的抑制作用，在葡萄灰霉病防治中具有良好的應(yīng)用潛力。  關(guān)鍵詞：葡萄；傷流液；內(nèi)生菌；鑒定；抗??；灰霉病菌  中圖分類(lèi)號(hào)： S 663.1        文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A         文章編號(hào)： 0513-353X（ 2018） 11-2106-15 Isolation and Identification of Endophytes from Grape Bleeding Sap and Their Disease Resistance Function Analysis  ZHENG Ting， ZHANG Peian， ZHANG Kekun， JIU Songtao， ZHU Xudong， SONG Changnian，JIA Haifeng*， and FANG Jinggui*（ College of Horticulture， Nanjing Agricultural University， Fruit Crop Variety Improvement and Seedling Propagation Engineering Center of Jiangsu Province， Nanjing 210095， China）  Abstract： In order to explore the roles of grape endophytes played in grey mould resistance， four universal endophyte strains（ Rhodotorula mucilaginosa， Cryptococcus， Rahnella aquatilis and Serratia proteamaculans） were closely related， but far from Rhodotorula mucilaginosa and Cryptococcus） were isolated and purified from grape bleeding sap. Morphological observation， physiological characterization and 16S rDNA sequence analysis suggested Rahnella aquatilis and Serratia proteamaculans were closely related， but far from Rhodotorula mucilaginosa and Cryptococcus. In vitro antibacterial effects of the isolated endophytes were tested via plate co-cultivation and grape berry co-infection of both grey mould and the individual endophyte. The results indicated strong inhibition of grey moulds growth by Cryptococcus， Rahnella aquatilis and Serratia proteamaculans. In addition， berries co-infected with Botrytis cinera and the endophyte showed reduced rate of water loss， increased anti-disease metabolites  鄭   婷，張培安，張克坤，糾松濤，朱旭東，宋長(zhǎng)年，賈海鋒，房經(jīng)貴 . 葡萄傷流液中內(nèi)生菌分離鑒定與抗病功能分析 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (11)： 2106 2120.                                                                                 2107 （ flavonoids and total phenols） and the increment activities of SOD， CAT， POD， and PPO， together with the increased expression of disease resistant genes VvPR17， VvDW， VvChi and VvWRKY. These shed lights on the pathways endophytes participating in Botrytis cinera resistance. These results are of practical interest for improving grapevine resistance to grey mould. Keywords： grape； bleeding sap； endophyte； identification； disease resistance； Botrytis cinera 由灰葡萄孢（ Botrytis cinerea）侵染引起的葡萄采后灰霉病常造成很大經(jīng)濟(jì)損失（陳宇飛  等，2006； Latorre et al.， 2015）。傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)和化學(xué)防治措施對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體安全存在一定隱患（石延霞  等， 2014），隨著生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展，生物防治成為病害防治的研究熱點(diǎn)（周登博  等， 2017；Rahman et al.， 2018），開(kāi)發(fā)新型生物農(nóng)藥成為當(dāng)前發(fā)展趨勢(shì)（ Thandavelu et al.， 2003）。目前已有數(shù)種微生物被證實(shí)對(duì)葡萄灰霉病菌具有拮抗作用，如枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis（ Rotolo et al.， 2017）、綠色木霉 Trichoderma viride（康萍芝  等， 2007）、粉紅粘帚霉 Gliocladium roseum（孟祥東  等， 2015）、假絲酵母 Candida guilliermondii（ Zahavi et al.， 2000）、季也蒙畢赤氏酵母 Pichia guilliermondii（ Saligkarias et al.， 2002）、羅倫隱球酵母 Ctyptocccus laurentii（ Yu et al.， 2008）等，其抑菌率達(dá)20% 80%。傳統(tǒng)的生物防治僅僅依賴于外源微生物，這導(dǎo)致外源微生物本身和次級(jí)代謝產(chǎn)物的安全性無(wú)法保證，因此篩選出植物自身內(nèi)生菌進(jìn)行生物防治顯得尤為重要（周泠璇和劉婭， 2016）。  內(nèi)生菌是生活在植物體內(nèi)而不會(huì)引起植物產(chǎn)生明顯病害病癥的一類(lèi)真菌或細(xì)菌（ Hartley et al.，2015； Wani et al.， 2015）。內(nèi)生菌來(lái)源廣，種類(lèi)多，其合成物大多具有抗菌、生物防治等活性（劉慧芹  等， 2014； Nair & Padmavathy， 2014； Azad & Kaminskyj， 2016； Yang et al.， 2016；王春偉  等，2018）。葡萄上關(guān)于內(nèi)生菌的研究多數(shù)是圍繞根、莖、葉片、果梗、果肉和果皮等展開(kāi)的（ Chambers et al.， 2010； Yang et al.， 2016），本研究中以葡萄休眠期樹(shù)液為材料，分離其傷流液中普遍存在的內(nèi)生菌，通過(guò)抑菌測(cè)試尋找對(duì)灰霉病菌具有拮抗作用的內(nèi)生菌，為開(kāi)發(fā)葡萄天然生物抑菌劑提供科學(xué)依據(jù)。  1  材料與方法  1.1  試材與內(nèi)生菌分離純化  試材為江蘇省句容市陳武鎮(zhèn)江蘇省農(nóng)博園（ 119.2E， 32.0S）內(nèi) 5 年生白羅莎里奧葡萄樹(shù)液流動(dòng)期的樹(shù)液（即傷流液）。 2017 年 3 月中旬（樹(shù)液流動(dòng)期），選擇健壯枝條，在其頂端剝離韌皮部5 cm 左右，露出木質(zhì)部，用乙醇和無(wú)菌水沖洗，用脫脂棉包裹韌皮部頂端，使用經(jīng)高溫滅菌的 50 mL開(kāi)口離心管收集傷流液 15 mL，然后在無(wú)菌條件下用不結(jié)合蛋白質(zhì)的 0.22 µm 微濾膜過(guò)濾。  采用平板分離法，參考李太元和許廣波（ 2015）的方法制作 PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）用于培養(yǎng)真菌和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基用于培養(yǎng)細(xì)菌，取 200 µL 傷流液均勻涂板，以涂蒸餾水作為對(duì)照，置于 28 恒溫培養(yǎng)箱中。培養(yǎng) 2 4 d 后挑取平板上的單菌落分別接種于 PDA 培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，歷時(shí) 3 4 代經(jīng)反復(fù)純化得到較純的菌株。  1.2  內(nèi)生菌鑒定  1.2.1  形態(tài)學(xué)與生理生化鑒定使用 Leica TL 3000 Ergo 體視顯微鏡通過(guò) NA 0.73 分辨率觀察內(nèi)生菌的外觀形態(tài)，使用 Leica Zheng Ting， Zhang Peian， Zhang Kekun， Jiu Songtao， Zhu Xudong， Song Changnian， Jia Haifeng， Fang Jinggui. Isolation and identification of endophytes from grape bleeding sap and its disease resistance function analysis. 2108                                                                    Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (11)： 2106 2120. DM4 B 正置顯微鏡 10× 目鏡、 40× 物鏡觀察內(nèi)生菌的細(xì)胞形態(tài)， 20× 物鏡通過(guò)結(jié)晶紫（初染）碘液（酶染）酒精（脫色）蕃紅（復(fù)染）鑒定內(nèi)生菌的革蘭氏屬性，對(duì)其形態(tài)學(xué)特征加以描述。  參考李太元和許廣波（ 2015）的方法對(duì)內(nèi)生菌進(jìn)行碳源（葡萄糖、木糖、麥芽糖、山梨醇、甘露醇、棉子糖、側(cè)金盞花醇）利用測(cè)定，并對(duì) pH 值、硝酸鹽還原、氨基酸、 H2S 產(chǎn)氣等相關(guān)生理生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。  1.2.2  分子生物學(xué)鑒定參考丁延芹等（ 2014）報(bào)道的總 DNA 提取方法。模板采用挑取菌落制成的菌液，真菌鑒定 28S rDNA，引物為 ITS 1（ TCCGTAGGTGAACCTGCGC）和 ITS 4（ TCCGTAGGTGAACCTGCGC）；細(xì)菌鑒定 16S rDNA，引物為 27 F（ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和 1492 R（ TACGGCTACCTTGTA CGACTT）。擴(kuò)增采用 25 µL 反應(yīng)體系（ 2 µL 模板菌液、 12.5 µL mix、 1 µL Primer 1、 1 µL Primer 2、8.5 µL ddH2O），反應(yīng)過(guò)程： 94 預(yù)變性 5 min， 94 變性 30 s， 55 退火 30 s， 72 延伸 90 s， 35個(gè)循環(huán)后 72  10 min。 PCR 產(chǎn)物采用 AXYGEN AP-GX-50G AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒回收，與 pMD19-T Vector 載體連接，轉(zhuǎn)化 Trans 5 的感受態(tài)細(xì)胞。按照下列組分配制連接反應(yīng)液： pMD19-T Vector 0.5 µL，回收產(chǎn)物 5 µL， Solution I 4.5 µL。反應(yīng)條件： 16 連接過(guò)夜。用含 100 mg · L-1氨芐霉素的 LB 選擇培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性菌落，提取重組子質(zhì)粒的 DNA，經(jīng)通用引物 PCR 驗(yàn)證送上海生工測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用 NCBI BLAST 軟件進(jìn)行序列分析，搜索相似性最高的序列，并利用 MEGA 7 軟件制作系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，鑒定出內(nèi)生菌。  1.3  內(nèi)生菌對(duì)灰霉病菌抗性鑒定  1.3.1  與灰霉病菌的平板檢測(cè) 灰霉病菌來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室保存，使用時(shí)將斜面菌種轉(zhuǎn)接至 PDA 平板， 28 培養(yǎng)，待產(chǎn)孢子后挑取菌塊至無(wú)菌水中，用雙層紗布過(guò)濾獲得分生孢子懸浮液并稀釋為 105分生孢子  · mL-1的孢子懸浮液。  每組 4 個(gè)處理：分別吸取內(nèi)生菌 100 µL 涂于 PDA 培養(yǎng)基平板上，在平板中央接種灰霉病菌菌塊 3 mm × 3 mm（即內(nèi)生菌病原菌）；吸取灰霉病病原菌菌液 100 µL 凃板，中央接種內(nèi)生菌菌液50 µL（即病原菌內(nèi)生菌）；另外分別凃板內(nèi)生菌和灰霉病病原菌菌液作為對(duì)照。每個(gè)處理 3 組重復(fù)。觀察平板的生長(zhǎng)狀況，使用 0.1 mm 游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈大小。  1.3.2  與灰霉病菌互作的離體驗(yàn)證培養(yǎng)內(nèi)生菌的懸浮液以及灰霉病菌的孢子懸浮液，利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算濃度，將孢子含量控制在 108 · mL-1左右。  參考申順善等（ 2016）的方法在果實(shí)成熟期取長(zhǎng)勢(shì)良好且大小、成熟度基本一致的陽(yáng)光玫瑰果粒，分為 5 組，每組 20 個(gè)，先用自來(lái)水沖洗 30 min，再用 75%乙醇進(jìn)行表面消毒，用無(wú)菌水沖洗 3 次備用。使用滅菌解剖針在果粒表面均勻刺傷 3 個(gè)小孔，用注射器分別注射無(wú)菌水和 4 種純化內(nèi)生菌菌液 100 µL，然后再將每個(gè)處理分為兩組，一組 10 個(gè)果粒不處理，一組 10 個(gè)果粒待果面水分吸收后均勻噴灑灰霉病菌分生孢子懸浮液，置于 28 恒溫箱進(jìn)行保濕培養(yǎng)。觀察果面染菌情況，記錄病菌圈大小及顏色，用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)孢子數(shù)，每日稱(chēng)量果粒質(zhì)量，計(jì)算果粒失水速率：（原果粒質(zhì)量稱(chēng)量質(zhì)量） /原果粒質(zhì)量。切取病斑附近 1 cm 內(nèi)果肉用液氮速凍，保存于 80 冰箱備用。  參考曹建康等（ 2007）的方法測(cè)定果肉樣品類(lèi)黃酮、總酚含量和 SOD、 POD、 CAT、 PPO 等相關(guān)酶活性：采用氮藍(lán)四唑（ NBT）法測(cè)定超氧化物歧化酶（ SOD）活性，紫外吸收法測(cè)定過(guò)氧化氫酶（ CAT）活性，愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過(guò)氧化物酶（ POD）活性，鄰苯二酚比色法測(cè)定多酚氧化酶（ PPO）活性；采用 NaNO2-Al(NO3)3比色法測(cè)定類(lèi)黃酮含量， Folin-Ciocalteu 比色法測(cè)定總酚含量。  鄭   婷，張培安，張克坤，糾松濤，朱旭東，宋長(zhǎng)年，賈海鋒，房經(jīng)貴 . 葡萄傷流液中內(nèi)生菌分離鑒定與抗病功能分析 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (11)： 2106 2120.                                                                                 2109 利用改良 CTAB 法分別從離體侵染 4 d 后的葡萄果粒中提取總 RNA（初雪鵬  等， 2014）。取完整性良好的總 RNA 經(jīng) RNase-Free DNase處理（ TaKaRa， Japan），通過(guò) Smart SpecTMPlus 微量分光光度計(jì)（ Bio-Rad， California， USA）獲得 OD230 和 OD260 以評(píng)估 RNA 樣品的質(zhì)量和濃度。使用 PrimeScriptTMRT 試劑盒（ TaKaRa， Tokyo， Japan），按照公司產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作合成 cDNA。使用Primer 5 軟件（ http： /www.premierbiosoft.com/）設(shè)計(jì)的用于 qRT-PCR 的引物（表 1），選定 VvActin作內(nèi)部對(duì)照基因，檢測(cè)抗病相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)水平。  表 1  本研究所采用的引物序列  Table 1  Sequence of the primers used in this study 基因  Gene 上游引物（ 5 3）  Forward primer 下游引物（ 5 3）  Reverse primer NCBI 登錄號(hào)  NCBI accession number VvWRKY GGAAAGGAAACCCTCTCCAG TCAGCCTTCCTCTTCCTTGA JF500755 VvRP17 ACACACATTTGGCAGTGGAA CCCATTTCTAAGGCTGTTGC JQ248075 VvHSF CGGCTGTGGACGATCTTATT CTCCTTTGCGGAAGTAGTCG GU393313 VvDW AATCCTGGATGATGGGTTCA GGCTTTCGTGGTTATGGATG LOC100266400 VvDR CGGATTCTCCATTCCAAGAA CAAACCGTGAAACGGAAACT XM_002265958.3 VvChi CCCTCAATGCCCATTCCAAG AGTCCACCGGTTCCATGAAT XM_002266547.4VvActin TGAGCAAGGAAATTACTGCC TCATCGTATTCACCCTTGGA LOC100246825 采用 Microsoft Excel 2016 軟件處理數(shù)據(jù)和制圖，利用 SPSS 軟件進(jìn)行方差分析，用鄧肯氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)顯著性， P  No.3水拉恩式菌  > No.2 隱球菌。  對(duì)葡萄果粒先行接種內(nèi)生菌，再接種灰霉病病原菌，由圖 3 可知，內(nèi)生菌 No.1 菌株與無(wú)菌水對(duì)照處理后染菌的情況類(lèi)似，病原孢子及腐爛面積持續(xù)擴(kuò)增，證實(shí) No.1 菌株抑制灰霉病菌的效果不明顯；內(nèi)生菌 No.2、 No.3、 No.4 菌株有不同程度的抑菌能力，病原孢子不產(chǎn)生或者產(chǎn)生較慢，且較對(duì)照果肉腐爛的范圍較較小。  表 4  內(nèi)生菌 No.1、 No.2、 No.3 和 No.4 對(duì)葡萄灰霉病菌生長(zhǎng)抑制作用的抑菌圈大小  Table 4  Inhibition zone of No.1， No.2， No.3 and No.4 endophytes to grape Botrytis cinera                cm 互作關(guān)系  Interaction No.1 No.2 No.3 No.4 內(nèi)生菌病原菌  Endophyte Pathogen 0 （ 0.85 ± 0.03） ×（ 1.35 ± 0.04）  （ 2.34 ± 0.15）  × （ 2.48 ± 0.08）（ 2.86 ± 0.06） ×（ 3.74 ± 0.05）病原菌內(nèi)生菌  Pathogen Endophyte 0 （ 4.24 ± 0.12） ×（ 1.95 ± 0.06）  （ 6.23 ± 0.07）  × （ 4.44 ± 0.10）（ 9.12 ± 0.11） ×（ 8.54 ± 0.11）Zheng Ting， Zhang Peian， Zhang Kekun， Jiu Songtao， Zhu Xudong， Song Changnian， Jia Haifeng， Fang Jinggui. Isolation and identification of endophytes from grape bleeding sap and its disease resistance function analysis. 2112                                                                    Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (11)： 2106 2120. 圖 2  內(nèi)生菌 No.1、 No.2、 No.3 和 No.4（ No.）對(duì)葡萄灰霉病菌（ Bc）的平板抑菌驗(yàn)證   Fig. 2  Plate bacteriostatic test on grape Botrytis cinera（ Bc） of No.1， No.2， No.3 and No.4（ No.） endophytes 圖 3  內(nèi)生菌 No.1、 No.2、 No.3 和 No.4 對(duì)葡萄灰霉病菌的防治效果圖  Fig. 3  The control efficiency of No.1， No.2， No.3 and No.4 endophytes against grape Botrytis cinera in vitro 鄭   婷，張培安，張克坤，糾松濤，朱旭東，宋長(zhǎng)年，賈海鋒，房經(jīng)貴 . 葡萄傷流液中內(nèi)生菌分離鑒定與抗病功能分析 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (11)： 2106 2120.                                                                                 2113 從病原菌孢子數(shù)量（表 5）來(lái)看， 3 種內(nèi)生菌菌株的抑菌效果表現(xiàn)為 No.2 > No.4 > No.3，其中No.2 基本沒(méi)有病原菌孢子的產(chǎn)生，但腐爛面積較 No.3、 No.4 處理后大，褐變現(xiàn)象明顯。對(duì)接種病原菌的果粒染菌圈進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，無(wú)菌水對(duì)照的染菌范圍最大，可達(dá) 0.85 cm，接種 4 d 后 No.4 處理最小，為 0.45 cm。  表 5  病菌接種后染菌圈直徑和病原菌孢子數(shù)  Table 5  Inhibition zone and pathogen spores number on grape surface 處理  Treatment 直徑 /cm Diameter 4 d 時(shí)孢子數(shù)  Pathogen spores number at 4 d1 d 2 d 3 d 4 d 水 Water（對(duì)照 Control）  0.15 ± 0.01 a 0.20 ± 0.03 a 0.67 ± 0.04 a 0.85 ± 0.05 a （ 1.08 ± 0.07） × 108 a No.1 0.15 ± 0.01 a 0.20 ± 0.01 a 0.58 ± 0.04 b 0.78 ± 0.03 b （ 8.40 ± 0.53） × 107 b No.2 0.10 ± 0.03 b 0.15 ± 0.02 b 0.44 ± 0.04 c 0.65 ± 0.04 c （ 8.00 ± 0.21） × 105c No.3 0.15 ± 0.02 a 0.18 ± 0.01 a 0.43 ± 0.03 c 0.53 ± 0.03 d （ 2.10 ± 0.53） × 107d No.4 0.15 ± 0.02 a 0.18 ± 0.01 a 0.38 ± 0.03 d 0.45 ± 0.04 e （ 1.60 ± 0.40） × 106d 2.5  內(nèi)生菌處理的葡萄果粒接種灰霉病菌后的生理特征變化  4 種內(nèi)生菌處理過(guò)的葡萄果粒在接種病原菌后失水速率表現(xiàn)為 No.1 > 對(duì)照  > No.2 > No.3 > No.4 處理，且各處理的離體失水速率均呈線性變化（圖 4）。其中， No.1 處理的失水速率最快，處理后 4 d 高達(dá) 42.3%，其次為清水對(duì)照（ 38.5%）， No.3 與 No.4 處理的失水速率較為接近，處理后4 d 分別為 15.8%和 14.2%。  圖 4  內(nèi)生菌 No.1、 No.2、 No.3 和 No.4 處理葡萄果粒接種灰霉病菌后失水速率  Fig. 4  Rate of water loss of berries treated with No.1， No.2， No.3 and No.4 endophytes respectively after Botrytis cinera inoculation 葡萄果粒類(lèi)黃酮和總酚含量在灰霉病病原菌侵染后呈上升趨勢(shì)，且上升的速率和幅度與平板檢測(cè)的抗病性一致，同樣表現(xiàn)為 No.4 > No.3 > No.2 > No.1  對(duì)照，接種 4 d 時(shí) No.4 處理總酚含量最高（ 4.41 mg · g-1），類(lèi)黃酮含量為 7.20 mg · g-1，整體來(lái)看， 4 種內(nèi)生菌處理在接種后 2 4 d 的上升速率明顯高于 0 2 d（圖 5）。  Zheng Ting， Zhang Peian， Zhang Kekun， Jiu Songtao， Zhu Xudong， Song Changnian， Jia Haifeng， Fang Jinggui. Isolation and identification of endophytes from grape bleeding sap and its disease resistance function analysis. 2114                                                                    Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (11)： 2106 2120. 圖 5  內(nèi)生菌處理的葡萄果粒接種灰霉病菌后類(lèi)黃酮物質(zhì)和總酚含量  Fig. 5  Total polyphenolics and flavonoid content of berries treated with No.1， No.2， No.3 and No.4  endophytes respectively after Botrytis cinera inoculation 從圖 6 可以看出，陽(yáng)光玫瑰葡萄果粒中 4 種防御酶系在接種病原菌后的變化與其抗病性呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性， 4 種酶基本都在接種病原菌后 2 d 開(kāi)始迅速升高，其中 No.2、 No.3、 No.4 內(nèi)生菌處理在接種后 1 4 d， 4 種防御酶呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)， CAT 和 PPO 在 3 4 d 上升較為緩慢。從上升幅度來(lái)看 No.4 > No.3 > No.2 處理，與平板檢測(cè)的抗病性一致； No.1 菌株處理酶活的變化與清水對(duì)照基本一致，其中 SOD、 POD、 PPO 活性在病原菌接種后基本無(wú)變化或有小幅上升， CAT 活性在接種后呈下降趨勢(shì)，且清水對(duì)照的下降幅度大于 No.1 處理。  圖 6  內(nèi)生菌（ No.1、 No.2、 No.3 和 No.4）處理葡萄果粒接種灰霉病后 SOD、 POD、 CAT 和 PPO 的活性  Fig. 6  SOD， POD， CAT and PPO activities of berries treated with No.1， No.2， No.3 and No.4 endophytes  respectively after Botrytis cinera inoculation 鄭   婷，張培安，張克坤，糾松濤，朱旭東，宋長(zhǎng)年，賈海鋒，房經(jīng)貴 . 葡萄傷流液中內(nèi)生菌分離鑒定與抗病功能分析 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (11)： 2106 2120.                                                                                 2115 2.6  內(nèi)生菌的葡萄果粒接種灰霉病菌后相關(guān)基因表達(dá)量變化  選取葡萄抗病相關(guān)基因 VvWRKY、 VvPR17、 VvDW、 VvChi、 VvHSF 和 VvDR 進(jìn)行定量檢測(cè)，整體來(lái)看， No.1 處理中各抗病基因表達(dá)量普遍偏低，說(shuō)明粘紅酵母菌未使葡萄表現(xiàn)出抗病能力，與對(duì)照相比， No.2、 No.3、 No.4 處理發(fā)現(xiàn)葡萄 VvPR17、 VvDW、 VvChi 表達(dá)量上調(diào)，且上調(diào)程度與抗病能力呈正相關(guān)； VvWRKY 為類(lèi)黃酮合成的關(guān)鍵基因，其在對(duì)照中表達(dá)量極低，在 4 種內(nèi)生菌作用的條件下表達(dá)量急劇上升，其中 No.2 表達(dá)量最高， No.3 和 No.4 表達(dá)量相近； VvHSF 和 VvDR 為應(yīng)激反應(yīng)的響應(yīng)基因，病菌侵染后表達(dá)量呈大幅下降趨勢(shì)（圖 7）。  圖 7  內(nèi)生菌（ No.1、 No.2、 No.3 和 No.4）處理葡萄果粒接種灰霉病菌后抗病基因的表達(dá)  Fig. 7  Disease resistance genes expression of berries treated with No.1， No.2， No.3 and No.4 endophytes respectively after Botrytis cinera inoculation 3  討論  葡萄內(nèi)生菌菌群豐富（ Pinto et al.， 2014）， Martín 等（ 2013）從榆樹(shù)木質(zhì)部汁液中分離到內(nèi)生菌，前人已對(duì)內(nèi)生菌的抗病機(jī)制進(jìn)行了廣泛和深入的研究（ Gonzálezteuber， 2016）。水拉恩式菌和變形斑沙雷菌菌種相近，常見(jiàn)于土壤中，對(duì)楊樹(shù)促生以及楊樹(shù)潰瘍?。ㄋ畏夹? 等， 2017）、灰霉病，小麥全蝕病以及葡萄相關(guān)病害（ Habbadi et al.， 2017）有一定的防治作用，另外其具有良好的保水</p>

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