甜瓜肌醇半乳糖苷合成酶基因CmGAS1的表達(dá)與功能分析.pdf

園藝學(xué)報， 2018， 45 (10)： 1929 1940. Acta Horticulturae Sinica doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0766； http： /www. ahs. ac. cn 1929 收稿日期 ： 2018 07 03； 修回日期 ： 2018 09 22 基金項(xiàng)目 ： 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ 31201642， 31471895） ；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（ CARS-25） ；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（ 1610102016026， IVF-BRF2018011） * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail： fqscaas163.com， wanghuaisongcaas.cn） 甜瓜肌醇半乳糖苷合成酶基因 CmGAS1 的表達(dá)與功能分析 張瑞騰1,2，呂建春1，周夢迪1，劉靜霖3，李 仁3，郭仰東3，王懷松1,*，付秋實(shí)1,*（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西太谷 030801；3中國農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，北京 100193） 摘 要： 甜瓜（ Cucumis melo L.）是棉子糖系列寡糖（ Raffinose Family Oligosaccharides， RFOs）轉(zhuǎn)運(yùn)型植物。肌醇半乳糖苷合成酶（ GAS）是催化 RFOs 合成的關(guān)鍵酶。甜瓜 CmGAS1 基因（ GenBank 登錄號為 AY077642.1） 的 cDNA 全長為 1 903 bp， 開放閱讀框 （ ORF） 為 996 bp， 編碼 331 個氨基酸。 CmGAS1蛋白分子量約為 38 kD，理論等電點(diǎn)（ pI）為 4.81。氨基酸序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明， CmGAS1 氨基酸序列與黃瓜（ AAO84915.1）親緣關(guān)系最近，同源性為 98.79%，與西瓜（ Cla009222）同源性為 97.58%。熒光定量結(jié)果表明，甜瓜葉片從幼葉（庫）至成熟葉（源） CmGAS1 的表達(dá)顯著升高，第 5 節(jié)位葉片達(dá)到最大值。 去掉 50%葉片植株與對照相比， 完全展開功能葉片的 CmGAS1 表達(dá)量明顯升高。 應(yīng)用 CmGAS1特異性啟動子構(gòu)建 CmGAS1 的過表達(dá)載體，并采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)進(jìn)行甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了 PCR 陽性轉(zhuǎn)化植株，轉(zhuǎn)化植株完全展開功能葉片的凈光合速率以及葉片中的蔗糖、棉子糖、水蘇糖含量與野生型相比均有所提高。推測 CmGAS1 在甜瓜葉片棉子糖系列寡糖合成過程中起重要作用。 關(guān)鍵詞： 甜瓜；肌醇半乳糖苷合成酶；基因表達(dá)；遺傳轉(zhuǎn)化 中圖分類號： S 652 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號： 0513-353X（ 2018） 10-1929-12 Expression and Function Analysis of CmGAS1 in Melon ZHANG Ruiteng1,2， LÜ Jianchun1， ZHOU Mengdi1， LIU Jinglin3， LI Ren3， GUO Yangdong3， WANG Huaisong1,*， and FU Qiushi1,*（1Institute of Vegetables and Flowers， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China；2College of Horticulture， Shanxi Agricultural University， Taigu， Shanxi 030801， China；3College of Horticulture， China Agricultural University， Beijing 100193， China） Abstract： Melon belongs to a group of plants that mainly transport Raffinose Family Oligosac- charides（ RFOs） . Galactinol synthase（ GAS） is the key enzyme of RFOs synthesis. The aim of this study was to explore the function of CmGAS1 in melon. The full-length cDNA of CmGAS1（ accession number：AY077642.1） was 1 903 bp， and the open reading frame（ ORF） was 996 bp， encoding 331 amino acids. The molecular weight of CmGAS1 protein was about 38 kD， and the theoretical isoelectric point（ pI） Zhang Ruiteng， Lü Jianchun， Zhou Mengdi， Liu Jinglin， Li Ren， Guo Yangdong， Wang Huaisong， Fu Qiushi. Expression and function analysis of CmGAS1 in melon. 1930 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (10)： 1929 1940. was 4.81. Amino acid sequence alignment and phylogenetic analysis showed that the amino acid sequences of CmGAS1 had the closest genetic relationship with cucumber（ AAO84915.1） ， and the homology with cucumber was 98.79%. Homology with watermelon（ Cla009222） was 97.58%. RT-qPCR analysis showed that the expression of CmGAS1 gene increased significantly from young leaves（ sink） to mature leaves（ source） . Expression of the fifth leaf reached the maximum value. Compared with the control， gene expression of the fully expanded functional leaves increased distinctly when 50% leaves were removed. The over expression vector of CmGAS1 was constructed with the specific promoter. The genetic transformation of melon was mediated by Agrobacterium. The positive plants were obtained by PCR identification. The net photosynthetic rates， the content of sucrose， raffinose and stachyose all increased in positive plants compared with the wild type. These results suggested that CmGAS1 played an important role in RFOs synthesis in melon leaves. Keywords： melon； galactinol synthase； gene expression； genetic transformation 光合同化產(chǎn)物是果實(shí)產(chǎn)量與品質(zhì)形成的基礎(chǔ)，光合同化產(chǎn)物在光合器官的合成、韌皮部裝載以及在維管束中的運(yùn)輸是影響果實(shí)發(fā)育的主要因素（ Fu et al.， 2010， 2011b） 。同化物向韌皮部的裝載是同化物長距離運(yùn)輸?shù)拈_始，裝載物質(zhì)的成分、濃度及裝載機(jī)制等與植物的生長發(fā)育密切相關(guān)。 光合同化產(chǎn)物的韌皮部裝載可以通過共質(zhì)體途徑（ symplastic pathway） ，也可以通過質(zhì)外體途徑（ apoplastic pathway） （ Fu et al.， 2011a） 。蔗糖的裝載有 3 種機(jī)制：分別為擴(kuò)散型裝載（ diffusion） 、聚合物陷阱（ polymer trapping）和質(zhì)外體裝載（ apoplastic loading） （ Rennie & Turgeon， 2009； Fu et al.， 2011a） 。擴(kuò)散型裝載和聚合物陷阱都屬于共質(zhì)體裝載（ Reidel et al.， 2009； Rennie & Turgeon，2009； Turgeon， 2010a） 。同化物在韌皮部運(yùn)輸?shù)闹饕问绞翘穷悾计渌\(yùn)干物質(zhì)的 90%以上。大多數(shù)高等植物以蔗糖作為光合產(chǎn)物體內(nèi)運(yùn)輸?shù)闹饕问?。但自然界中尚有一些植物以棉子糖系列寡糖?Raffinose Family Oligosaccharides ， RFOs ）作為光合產(chǎn)物的主要運(yùn)輸形式，如葫蘆科（ Cucurbitaceae） 、唇形科（ Lamiaceae） 、木犀科（ Oleaceae）中的許多植物（ Turgeon et al.， 2001；Rennie & Turgeon， 2009； Cao， 2010； Fu et al.， 2011a） 。 甜瓜（ Cucumis melo L.）是棉子糖系列寡糖轉(zhuǎn)運(yùn)型植物的典型代表（ Haritatos et al.， 2000； Vo l k et al.， 2003） 。 甜瓜韌皮部裝載策略采用 “聚合物陷阱” 機(jī)制。 肌醇半乳糖苷合成酶 （ Galactinol Synthase，GAS）催化棉子糖系列寡糖生物合成反應(yīng)的第一步，催化合成肌醇半乳糖苷。肌醇半乳糖苷是目前所知的唯一的半乳糖基供體，進(jìn)而合成棉子糖、水蘇糖等寡糖（李芳和汪曉峰， 2008） 。 GAS 在棉子糖系列寡糖合成過程中起關(guān)鍵性的作用。 目前關(guān)于 GAS 的研究主要集中在逆境脅迫下該酶的活性及其基因表達(dá)量的變化。一些豆科（ Leguminosae）和禾本科（ Gramineae）植物的種子在成熟過程中迅速積累棉子糖系列寡糖，被認(rèn)為在種子脫水過程中起保護(hù)作用（ Peterbauer et al.， 2001；宗梅和蔡永萍， 2005） 。此外，不少在非生物脅迫條件下體內(nèi)不含棉子糖系列寡糖或含量極低的植物，受到低溫或其他滲透脅迫后該類物質(zhì)迅速積累，植物的抗逆性也迅速增強(qiáng)，在番茄（ Downie et al.，2003） 、水稻（ Tacahashi et al.， 1994） 、苜蓿（ Cunningham et al.， 2003） 、辣椒（繆旻珉 等， 2008）等植物中都存在類似的生理現(xiàn)象。擬南芥轉(zhuǎn)基因植株中， AtGAS 高效表達(dá)引起肌醇半乳糖苷和棉子糖系列寡糖水平增高，表現(xiàn)為葉片耐脫水性增加（ Taji et al.， 2002） 。以上研究表明逆境誘導(dǎo)的 GAS在積累肌醇半乳糖苷和棉子糖系列寡糖從而抵抗非生物脅迫的過程中發(fā)揮著極其關(guān)鍵的作用，并且通過轉(zhuǎn)入 GAS 基因的方法來提高植物的抗逆性是可行的。 張瑞騰，呂建春，周夢迪，劉靜霖，李 仁，郭仰東，王懷松，付秋實(shí) . 甜瓜肌醇半乳糖苷合成酶基因 CmGAS1 的表達(dá)與功能分析 . 園藝學(xué)報， 2018， 45 (10)： 1929 1940. 1931 由于 GAS 是催化棉子糖系列寡糖合成反應(yīng)第一步的酶，因此它可能控制著同化物的合成和運(yùn)輸，但是在這方面的研究極少。考慮到如果能夠?qū)⑻妓衔镉行У貜闹参锏娜~片中轉(zhuǎn)運(yùn)出去，二氧化碳同化和光合速率則都會增加，隨之作物的產(chǎn)量和品質(zhì)都會提高。改變 GAS 基因的表達(dá)很可能會改變源（葉）以及韌皮部中的棉子糖系列寡糖代謝模式，從而達(dá)到從根本上調(diào)控果實(shí)產(chǎn)量與品質(zhì)形成的目標(biāo)。因此，本研究中以典型的棉子糖系列寡糖轉(zhuǎn)運(yùn)型植物甜瓜為試材，探索通過提高甜瓜體內(nèi) CmGAS1 基因的表達(dá)來增強(qiáng)碳水化合物的合成和外運(yùn)，從而提高其品質(zhì)和產(chǎn)量，并通過基因工程獲得甜瓜轉(zhuǎn) CmGAS1 基因新種質(zhì)，為葫蘆科作物的遺傳育種研究進(jìn)行理論方面的探索。 1 材料與方法 1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)于 2015 年 7 月 2017 年 10 月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所甜瓜課題組實(shí)驗(yàn)室完成，甜瓜材料為 IVF 05 。 大腸桿菌菌株 DH5 購自天根生化科技（北京）有限公司，含有基因啟動子的載體 pSG8E 及表達(dá)載體 Pcambia2300，根癌農(nóng)桿菌菌株 C58 為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所甜瓜課題組實(shí)驗(yàn)室保存。 1.2 甜瓜 CmGAS1 的生物信息學(xué)分析 利用 DNAMAN 軟件進(jìn)行 GAS 相關(guān)序列的同源性分析； 利用 ProtParam 預(yù)測甜瓜 CmGAS1 序列編碼蛋白質(zhì)的分子量、理論等電點(diǎn)及親疏水性等信息；利用 MEGA6.0 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。 1.3 應(yīng)用 CmGAS1 基因特異性啟動子構(gòu)建過表達(dá)載體 含有 CmGAS1基因啟動子的載體 pSG8E由康奈爾大學(xué) Robert Turgeon教授實(shí)驗(yàn)室惠贈 （ Haritatos et al.， 2000）。利用限制性內(nèi)切酶（北京冰達(dá)生物科技有限公司） EcoR酶切質(zhì)粒 pSG8E。反應(yīng)條件： 37 溫浴 16 h；反應(yīng)體系： pSG8E 1 g， 10× Buffer 5 L，內(nèi)切酶 1 L， ddH2O 補(bǔ)至 50 L。利用瓊脂糖凝膠電泳（ 1%）分離酶切產(chǎn)物并利用 DNA 凝膠回收試劑盒（北京酷來搏科技有限公司）回收目的條帶。利用限制性內(nèi)切酶 EcoR酶切表達(dá)載體質(zhì)粒 Pcambia2300。反應(yīng)條件： 37 溫浴12 h，反應(yīng)體系： Pcambia2300 1 L， 10× Buffer 5 L，內(nèi)切酶 1 L， ddH2O 補(bǔ)至 50 L。利用 DNA回收試劑盒回收產(chǎn)物，利用 T4 連接酶（南京諾唯贊生物科技有限公司）連接目的基因及表達(dá)載體。反應(yīng)條件： 16 溫浴 16 h；反應(yīng)體系：目的基因產(chǎn)物 10 L， Pcambia2300 3 L， T4 連接酶 1 L，ddH2O 補(bǔ)齊至 25 L。將連接產(chǎn)物回收后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，涂板（卡那抗性）后挑單克隆搖菌，利用菌液 PCR 及酶切驗(yàn)證載體構(gòu)建結(jié)果。 1.4 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌及其轉(zhuǎn)化甜瓜 將構(gòu)建完成的表達(dá)載體通過電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)中，涂板挑單克隆后，利用菌液PCR 驗(yàn)證載體轉(zhuǎn)化是否成功。 PCR 反應(yīng)程序： 94 預(yù)變性 10 min； 94 變性 30 s， 56 退火 30 s，72 延伸 45 s， 35 個循環(huán)； 72 延伸 5 min。以甜瓜材料 IVF 05子葉為外植體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)進(jìn)行甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化（毛娟 等， 2013） 。 Zhang Ruiteng， Lü Jianchun， Zhou Mengdi， Liu Jinglin， Li Ren， Guo Yangdong， Wang Huaisong， Fu Qiushi. Expression and function analysis of CmGAS1 in melon. 1932 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (10)： 1929 1940. 1.5 CmGAS1 實(shí)時熒光定量 PCR 從上至下摘取甜瓜植株 1、 3、 5、 7、 9、 15 節(jié)位展開葉片，用來測定從幼葉（庫）至成熟葉（源）中 CmGAS1 表達(dá)量的變化。在甜瓜果實(shí)膨大期（授粉后 15 d 左右） ，選取長勢一致的植株，以不去葉為對照，去掉 50%葉片為去葉處理，用來測定源庫變化對 CmGAS1 表達(dá)量的影響。以甜瓜總 RNA為模板， 使用 TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒合成 cDNA， 根據(jù) TaKaRa熒光定量說明書及 Roche LightCycler 480 熒光定量 PCR 儀操作要求進(jìn)行實(shí)時熒光定量 PCR。 以甜瓜CmGAS1 基因序列設(shè)計熒光定量引物。上游引物 QF： 5-GTGAAGAAATGGTGGGAAGT-3，下游引物 QR： 5-TCAGCCTCAGACAGAACAGA-3。選擇甜瓜 Actin 為內(nèi)參基因，上游引物 CmactinF：5-TGAAGCACCACTCAACCCG-3，下游引物 CmactinR： 5-TGTCCGACCACTGGCATAGA-3。反應(yīng)體系共 20 L： 1 L cDNA 模板， 10 L SYBR Green I， 0.4 L 上游引物 QF， 0.4 L 下游引物 QR，8.2 L ddH2O。反應(yīng)程序： 95 預(yù)變性 3 min， 94 變性 30 s， 60 退火 30 s， 72 延伸 1 min，35 個循環(huán)。設(shè)置 3 個生物學(xué)重復(fù)， 3 個技術(shù)重復(fù)，用 2-Ct法對樣本基因進(jìn)行表達(dá)差異相對定量分析（ Schmittgen & Livak， 2008；劉培培 等， 2012） 。 1.6 甜瓜轉(zhuǎn)化苗葉片光合速率及糖含量的測定 光合速率測定：采用 LI-6400 型光合儀（ LI-COR， USA） ，于上午 9： 00 11： 00 測定完全展開葉的凈光合速率 （ Pn） 。 糖含量的測定： 取完全展開功能葉片 0.5 g， 用 5 mL 80%乙醇研碎， 于 80 下浸提 30 min， 4 000 r · min-1離心；收集上清液，再用 5 mL 80%乙醇清洗殘?jiān)瑯咏?、離心；取上清液，合并提取液，搖勻后取 2 mL 蒸干，用 1 mL 重蒸水溶解過濾后供色譜測定。蔗糖、棉子糖、水蘇糖均采用高效液相色譜（ HPLC）測定。采用日本島津 CLC-NH2柱，工作條件：柱 40 ，流速 l.0 mL · min-1，檢測器 RID-10A 示差折光檢測器，流動相為乙腈 水 = 70 30（體積比） ，每次進(jìn)樣體積為 6 L， Class-vp 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。根據(jù)樣品峰高和各種糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算糖含量。 2 結(jié)果與分析 2.1 甜瓜 CmGAS1 生物信息學(xué)分析 在 GenBank 中搜索，甜瓜 CmGAS1 基因的登錄號為 AY077642.1。開放閱讀框?yàn)?996 bp，編碼331 個氨基酸，編碼蛋白分子式為 C1755H2630N422O503S17，分子量為 38 kD，理論等電點(diǎn)（ pI）為 4.81。帶負(fù)電的氨基酸 （ Asp + Glu） 47 個， 帶正電的氨基酸 （ Arg + Lys） 31 個， 脂肪族氨基酸指數(shù)為 80.39，親水性平均系數(shù)（ GRAVY）為 0.287。 通過 NCBI 數(shù)據(jù)庫和葫蘆科基因組數(shù)據(jù)庫（ CGD， http： /www.icugi.org/cgi-bin/ICuGI/genome/ index.cgi）上 BLAST 與甜瓜 CmGAS1 氨基酸的同源序列，同時在 DNAMAN 軟件上進(jìn)行氨基酸同源性比對，甜瓜 CmGAS1 與黃瓜（ AAO84915.1） 、西瓜（ Cla009222） 、土瓶草（ GAV71663.1） 、蓖麻（ EEF43147.1） 、葡萄（ ARS22082.1） 、石榴（ OWM62885.1） 、圓果種黃麻（ OMO64056.1） 、長果種黃麻 （ OMO82198.1） 、 麻瘋樹 （ XP_012082953.1） 、 擬南芥 （ NP_176053.1） 、 兵豆 （ ALO17645.1） 、可可（ EOX95367.1） 、番茄（ NP_001234668.2） 、木薯（ AIE11286.1） 、煙草（ NP_001312500.1） 、油菜（ ADG03603.1） 、甘藍(lán)（ XP_013637398.1） 、辣椒（ NP_001311705.1） 、紫苜蓿（ AAM97493.1） 、大豆（ AAM96867.1） 、胡蘿卜（ XP_017224651.1） 、玉米（ AAQ07248.1） 、丹參（ ACT34765.1） 、小麥（ BAF51565.1） 、紫毛蕊花（ ABQ12640.1）和匍匐筋骨草（ CAB51533.1） GAS 氨基酸序列相似張瑞騰，呂建春，周夢迪，劉靜霖，李 仁，郭仰東，王懷松，付秋實(shí) . 甜瓜肌醇半乳糖苷合成酶基因 CmGAS1 的表達(dá)與功能分析 . 園藝學(xué)報， 2018， 45 (10)： 1929 1940. 1933 性分別為 98.79%、 97.58%、 77.34%、 77.04%、 75.68%、 75.07%、 74.85%、 74.85%、 74.78%、 73.73%、73.73%、 73.59%、 73.08%、 72.92%、 72.30%、 71.93%、 71.93%、 71.51%、 70.69%、 69.73%、 69.23%、68.90%、 68.55%、 68.37%、 68.28%和 67.16%（圖 1） 。 Zhang Ruiteng， Lü Jianchun， Zhou Mengdi， Liu Jinglin， Li Ren， Guo Yangdong， Wang Huaisong， Fu Qiushi. Expression and function analysis of CmGAS1 in melon. 1934 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (10)： 1929 1940. 圖 1 甜瓜與其他植物 GAS 氨基酸序列比對 Fig. 1 Alignment of amino acid of GAS from melon and other plants 利用 MEGA6.0 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖 2） ，比較甜瓜 CmGAS1 氨基酸序列與不同物種間的親緣關(guān)系，發(fā)現(xiàn)甜瓜 CmGAS1 氨基酸序列與黃瓜（ AAO84915.1）和西瓜（ Cla009222）聚為一類，表明它們的親緣關(guān)系最近，與土瓶草（ GAV71663.1）和蓖麻（ EEF43147.1）親緣關(guān)系次之，與紫毛蕊花（ ABQ12640.1）和匍匐筋骨草（ CAB51533.1）等的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。 圖 2 甜瓜 CmGAS1 與其他植物 GAS 的進(jìn)化樹分析 Fig. 2 A phylogenetic tree of GAS1 from melon and GAS from other plants 張瑞騰，呂建春，周夢迪，劉靜霖，李 仁，郭仰東，王懷松，付秋實(shí) . 甜瓜肌醇半乳糖苷合成酶基因 CmGAS1 的表達(dá)與功能分析 . 園藝學(xué)報， 2018， 45 (10)： 1929 1940. 1935 2.2 源庫變化對 CmGAS1 表達(dá)的影響 從上至下摘取甜瓜植株 1、 3、 5、 7、 9、 15 節(jié)位展開葉片，用來測定從幼葉（庫）至成熟葉（源）中 CmGAS1 表達(dá)量的變化。從圖 3 中可以看出，第 5 節(jié)位完全展開功能葉片 CmGAS1 表達(dá)量最高，為第 1 節(jié)位幼葉的 42.03 倍； 第 9 節(jié)位葉片 CmGAS1 基因的表達(dá)與第 5 和 7 節(jié)位葉片相比顯著下降，第 15 節(jié)位葉片（衰老葉片）基因的表達(dá)又有所回升。 在甜瓜果實(shí)膨大期（授粉后 15 d 左右）進(jìn)行去葉處理。與對照相比，去 50%葉片植株的完全展開功能葉片的 CmGAS1 表達(dá)量有明顯升高（圖 3） 。 圖 3 不同節(jié)位甜瓜葉片以及去葉處理對甜瓜 CmGAS1 表達(dá)的影響 Fig. 3 CmGAS1 relative expression of different node leaves and source reducing treatments 2.3 過表達(dá)載體構(gòu)建 使用限制性內(nèi)切酶 EcoR酶切質(zhì)粒 pSG8E，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，獲得了長度為 6 kb 左右包含特異性啟動子的甜瓜 CmGAS1 目的基因條帶（圖 4） ，利用膠回收試劑盒回收目的條帶并保存。利用 T4 連接酶將目的基因與表達(dá)載體連接，構(gòu)建 Pcambia2300-CmGAS1 質(zhì)粒載體（圖5） 。 圖 4 含有特異性啟動子的目的基因 CmGAS1 酶切結(jié)果 M： Marker S Plus； 1 6：含有特異性啟動子的目的基因 CmGAS1。Fig. 4 Results of enzymatic digestion of target gene CmGAS1 with specific promoter M： Marker S Plus； 1 6： Target gene CmGAS1 with specific promoter.圖 5 Pcambia2300-CmGAS1 質(zhì)粒載體構(gòu)建 M： Marker DL2000； 1 2： Pcambia2300 質(zhì)粒載體； 3： Pcambia2300-CmGAS1 質(zhì)粒載體。 Fig. 5 Construction of Pcambia2300-CmGAS1 plasmid vector M： Marker DL2000； 1 2： Pcambia2300 plasmid vector； 3： Pcambia2300-CmGAS1 plasmid vector. Zhang Ruiteng， Lü Jianchun， Zhou Mengdi， Liu Jinglin， Li Ren， Guo Yangdong， Wang Huaisong， Fu Qiushi. Expression and function analysis of CmGAS1 in melon. 1936 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (10)： 1929 1940. 將連接產(chǎn)物回收后，將含有 Pcambia2300-CmGAS1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，菌液 PCR 驗(yàn)證，結(jié)果顯示載體中含有目的基因（圖 6） 。 EcoR酶切驗(yàn)證結(jié)果如圖 7 所示， 載體 Pcambia2300-CmGAS1 被酶切為 Pcambia2300 質(zhì)粒和目的基因兩條帶。經(jīng)過菌液 PCR 及酶切驗(yàn)證表明載體構(gòu)建成功。 圖 6 Pcambia2300-CmGAS1 質(zhì)粒菌液 PCR 結(jié)果 M： Marker ； 1 2： Pcambia2300-CmGAS1 的大腸桿菌菌液 PCR 產(chǎn)物； 3： pSG8E 質(zhì)粒； 4： Pcambia2300 空載體。 Fig. 6 PCR amplified product of Pcambia2300-CmGAS1 plasmid vector M： Marker ； 1 2： PCR products of Escherichia coli from Pcambia2300-CmGAS1； 3： pSG8E plasmid； 4： Pcambia2300 empty plasmid vector. 圖 7 載體 Pcambia2300-CmGAS1 的 EcoR酶切驗(yàn)證 M： 1 kb plus marker； 1：未酶切 Pcambia2300-CmGAS1； 2 3：用 EcoR酶切后的 Pcambia2300-CmGAS1 質(zhì)粒（上條帶為質(zhì)粒 Pcambia2300，下條帶為目的基因） ； 4：空載體。 Fig. 7 Restriction enzyme analysis of Pcambia2300-CmGAS1 vector M： 1 kb plus marker； 1： Non-enzymatic digestion； 2 3： Enzymatic digestion（ The upper strip was plasmid Pcambia2300 and the next stripe was the target gene） ； 4： Empty plasmid vector. 2.4 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 將構(gòu)建好的 Pcambia2300-CmGAS1表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中，經(jīng)菌液 PCR 驗(yàn)證，表明農(nóng)桿菌菌液中含有甜瓜 CmGAS1 目的基因，載體已成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中（圖 8） ，可以進(jìn)行后期的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。 2.5 甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化 采用甜瓜 IVF 05子葉為外植體（圖 9，A），利用含有 Pcambia2300-CmGAS1 的農(nóng)桿菌菌液侵染（ OD600 = 0.25） 15 min 后，接種于MS 誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基（ MS + 1.0 mg · L-16-BA + 1.0 mg · L-1ABA）上進(jìn)行共培養(yǎng) 2 3 d（圖 9，B）。然后轉(zhuǎn)移至分化抗性培養(yǎng)基（ MS + 1.0 mg · L-1 6-BA + 1.0 mg · L 1ABA + 300 mg · L-1 Cef）中，約 4 周左右即可分化出抗性不定芽（圖 9， C），長到 1 2 cm 時將不定芽切下，分株移入 MS 生根培養(yǎng)基（ MS + Cef 100 mg · L-1），約兩周左右即可生根（圖 9， D）。以 100 mg · L-1卡那霉素篩選轉(zhuǎn)化體，獲得了完整的轉(zhuǎn)化植株（圖 9， E）。 圖 8 轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌 PCR 結(jié)果 M： Marker ； 1： Pcambia2300 空載體； 2： pSG8E 質(zhì)粒； 3 4：轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。 Fig. 8 Results of Agrobacterium tumefaciens PCR M： Marker ； 1： Pcambia2300 empty plasmid vector； 2： pSG8E vector； 3 4： Transferred into Agrobacterium tumefaciens. 張瑞騰，呂建春，周夢迪，劉靜霖，李 仁，郭仰東，王懷松，付秋實(shí) . 甜瓜肌醇半乳糖苷合成酶基因 CmGAS1 的表達(dá)與功能分析 . 園藝學(xué)報， 2018， 45 (10)： 1929 1940. 1937 圖 9 轉(zhuǎn)化苗的獲得 A：甜瓜種子萌發(fā)； B：共培養(yǎng)； C：誘導(dǎo)不定芽； D：幼苗生根； E：轉(zhuǎn)化苗移栽。 Fig. 9 Results of transformation seedlings A： Melon seed germination； B： Co-cultivation； C： Shoot regeneration； D： Root formation； E： Transplanted seedlings. 2.6 甜瓜轉(zhuǎn)化植株 T0代 PCR 及 qRT-PCR 鑒定 提取生根后移栽成活的轉(zhuǎn)化植株葉片的 DNA 進(jìn)行 PCR 檢測。以 pSG8E 質(zhì)粒為陽性對照，野生型植株 DNA 為陰性對照進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，結(jié)果表明轉(zhuǎn)化株和陽性對照均擴(kuò)增出目的條帶且大小一致，而陰性對照無擴(kuò)增條帶。 8 株轉(zhuǎn)化株葉片中的 CmGAS1 的表達(dá)均顯著高于野生型，尤其是轉(zhuǎn)化苗 2、 3、 4（圖 10） 。 圖 10 轉(zhuǎn)化苗的 PCR 及 qRT-PCR 檢測 M： Marker 2000； 1 8：轉(zhuǎn)化株； 9：質(zhì)粒； WT：野生型植株。 Fig. 10 Detection of transformed melon plants by PCR and qRT-PCR M： Marker 2000； 1 8： Transformed plant； 9： Plasmid； WT： Wild type plant. Zhang Ruiteng， Lü Jianchun， Zhou Mengdi， Liu Jinglin， Li Ren， Guo Yangdong， Wang Huaisong， Fu Qiushi. Expression and function analysis of CmGAS1 in melon. 1938 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (10)： 1929 1940. 2.7 甜瓜轉(zhuǎn)化苗光合速率及糖含量的測定 選取 CmGAS1 表達(dá)量較高的轉(zhuǎn)化苗 2、 3、 4 進(jìn)行檢測，與野生型相比，陽性轉(zhuǎn)化株完全展開功能葉片的凈光合速率顯著升高，葉片中的蔗糖、棉子糖、水蘇糖均有所提高，但其中轉(zhuǎn)化苗 4 中的棉子糖，轉(zhuǎn)化苗 2 中的水蘇糖與野生型無顯著差異（表 1） 。 表 1 葉片光合速率及糖含量 Table 1 Photosynthetic rates and sugar content in melon leaves 材料 Material Pn/（ mol · m-2· s-1） 蔗糖 /（ mg · g-1） Sucrose 棉子糖 /（ mg · g-1） Raffinose 水蘇糖 /（ mg · g-1） Stychose 野生型 Wild type 10.86 ± 0.24 b 1.86 ± 0.02 c 0.53 ± 0.03 b 0.89 ± 0.03 b 轉(zhuǎn)化苗 2 Transformed seedling 2 13.31 ± 0.