提高春季西瓜未授粉子房胚狀體誘導(dǎo)率的方法.pdf

提高春季西瓜未授粉子房胚狀體誘導(dǎo)率 的方法 閔子揚(yáng) 1，2鄒 甜 1阮萬輝 2孫小武 1* （ 1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128； 2 湖南省蔬菜研究所，湖南長(zhǎng)沙 410125） 摘 要：為提高春季西瓜未授粉子房的胚狀體誘導(dǎo)率、加速西瓜單倍體育種進(jìn)程，以早佳8424西瓜未授粉子房為材料，對(duì) 影響春季西瓜未授粉子房胚狀體誘導(dǎo)率的因素進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：摘取子房時(shí)盡量保留最長(zhǎng)果柄，然后將帶果柄子房用 0.02 mg·L -1 的TDZ溶液浸泡10 min，最后將其置于15 恒溫條件下預(yù)處理2 d，能夠?qū)⒋杭疚鞴衔词诜圩臃康呐郀铙w誘導(dǎo) 率從3.5%提高到15.9%。 關(guān)鍵詞：西瓜；春季；未授粉子房；胚狀體；誘導(dǎo) 織途徑形成的再生植株（Ramsay et al.，2003；趙珺， 2007） 。這提醒我們?cè)谶M(jìn)行西瓜未授粉子房離體培 養(yǎng)以創(chuàng)制單倍體植株的過程中，提高胚狀體的誘導(dǎo) 率是一個(gè)需要解決的關(guān)鍵問題。 TDZ（噻苯?。┦且环N新型植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑， 具有細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的雙重功效，廣泛應(yīng)用于 誘導(dǎo)植物愈傷組織形成和體細(xì)胞胚分化（徐曉峰和 黃學(xué)林，2003），已在香蕉（魏岳榮 等，2007）、非 洲紫羅蘭（楊先泉 等，2010） 、南瓜（閔子揚(yáng) 等， 2016）等作物的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)中取得了較好效果。 本試驗(yàn)以TDZ為預(yù)處理激素，探討其對(duì)西瓜胚狀 體誘導(dǎo)效果的影響。 參照前期研究（閔子揚(yáng) 等，2016） ，筆者已建 立了一套誘導(dǎo)率較高的西瓜未授粉子房離體培養(yǎng)誘 導(dǎo)胚狀體再生的技術(shù)體系，主要技術(shù)路線如下：以 開花前一天的西瓜未授粉子房為材料，流水沖洗30 min后在超凈工作臺(tái)上用75%酒精消毒30 s，無菌 水沖洗3次，去除子房外表皮后橫切成1 mm左右 的薄片，然后在3%次氯酸鈉溶液中消毒2 min， 無菌水沖洗5次后接種于MS+30 g·L -1 蔗糖+7 g·L -1 瓊脂粉+0.04 mg·L -1TDZ的誘導(dǎo)胚狀體發(fā)生的培 養(yǎng)基上，35 黑暗條件下熱激5 d后轉(zhuǎn)到組培室培 養(yǎng)，28 d后統(tǒng)計(jì)胚狀體誘導(dǎo)率。通過上述技術(shù)體系 能夠獲得較高的胚狀體誘導(dǎo)率，但試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn) 材料的種植季節(jié)不同其誘導(dǎo)率存在顯著差異，春季 閔子揚(yáng)，男，博士研究生，研究實(shí)習(xí)員，專業(yè)方向：瓜類蔬菜遺傳育種， E-mail：minziyang1220163.com *通訊作者（Corresponding author）：孫小武，男，教授，博士生導(dǎo)師， 專業(yè)方向：瓜類蔬菜遺傳育種，E-mail：sunxiaowu2007126.com 收稿日期：2017-11-09；接受日期：2018-02-28 基金項(xiàng)目：湖南省科技廳重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2016NK2193） 西瓜（Citrullus lanatus）是葫蘆科重要的蔬菜 作物之一，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)和保健功能，深受消費(fèi) 者喜愛。我國(guó)作為西瓜的生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，其產(chǎn)量 占世界總產(chǎn)量的60%以上，但我國(guó)西瓜育種水平 相對(duì)滯后，品種類型無法完全滿足市場(chǎng)需求，因此， 提高我國(guó)西瓜育種水平、增強(qiáng)西瓜產(chǎn)業(yè)國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力 具有重要意義。 單倍體育種對(duì)于加速育種進(jìn)程、創(chuàng)新種質(zhì)資 源、構(gòu)建遺傳圖譜等均具有重要意義（袁素霞 等， 2010；Qiao et al.，2015）。單倍體的獲得方法主要 有離體雄核培養(yǎng)和離體雌核培養(yǎng)，但在葫蘆科作物 上以未授粉子房或胚珠為外植體的離體雌核培養(yǎng)為 主（孫守如 等，2013；趙曉菲，2014）。離體雌核 培養(yǎng)過程中再生植株的產(chǎn)生方式有兩種，一種是誘 導(dǎo)形成愈傷組織后再分化產(chǎn)生芽，最后形成完整再 生植株；另一種是以胚狀體發(fā)育途徑直接形成再生 植株。相關(guān)研究表明，愈傷組織途徑形成的再生植 株大部分起源于體細(xì)胞，而以胚狀體發(fā)育途徑形成 的再生植株中單倍體植株的比例顯著高于以愈傷組 67 新優(yōu)品種 栽培管理 本期視點(diǎn) 產(chǎn)業(yè)市場(chǎng) 病蟲防控 67 研究論文 中 國(guó) 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 2018（5）：67 - 70 西瓜未授粉子房胚狀體誘導(dǎo)率僅為3.5%，而秋季 誘導(dǎo)率最高可達(dá)20.2%，并且這種現(xiàn)象在南瓜、西 葫蘆等瓜類作物上也有報(bào)道（謝冰 等，2006；孫 守如 等，2013） 。為提高春季西瓜未授粉子房的胚 狀體誘導(dǎo)率、延長(zhǎng)試驗(yàn)可操作時(shí)間、加速西瓜單倍 體育種進(jìn)程，本試驗(yàn)在前期已建立的西瓜未授粉子 房離體培養(yǎng)誘導(dǎo)胚狀體再生技術(shù)體系的基礎(chǔ)上，以 春季西瓜未授粉子房為研究對(duì)象，探索提高春季西 瓜未授粉子房胚狀體誘導(dǎo)率的方法，以期能夠加速 西瓜單倍體育種進(jìn)程，為我國(guó)西瓜種質(zhì)資源創(chuàng)新、 新品種選育、基因工程相關(guān)研究提供幫助。 1 材料與方法 1.1 試驗(yàn)材料 供試西瓜品種為早佳8424，由湖南省蔬菜研 究所提供。試驗(yàn)材料于2016年4月10日定植在湖 南省蔬菜研究所高橋科研基地的塑料大棚中，5月 20日第2朵雌花出現(xiàn)時(shí)開始取樣接種。以下各處 理每處理接種3瓶，每瓶9個(gè)外植體，3次重復(fù)。 1.2 試驗(yàn)方法 1.2.1 果柄長(zhǎng)度對(duì)胚狀體誘導(dǎo)率的影響 取樣時(shí)， 分別以最長(zhǎng)果柄、1/2果柄、無果柄3種類型（圖1） 的西瓜未授粉子房為材料，用0.02 mg·L -1 的TDZ 溶液浸泡10 min后置于保濕盒中，15 恒溫條件 下放置2 d，然后按照已建立的技術(shù)體系進(jìn)行接種， 培養(yǎng)28 d后分別統(tǒng)計(jì)西瓜未授粉子房胚狀體誘 導(dǎo)率。 胚狀體誘導(dǎo)率=（形成胚狀體總數(shù)/膨大胚珠總 數(shù)）×100% 1.2.2 激素預(yù)處理方式對(duì)胚狀體誘導(dǎo)率的影響 以 果柄最長(zhǎng)時(shí)的西瓜未授粉子房為材料，分別用 0.01、0.02、0.03 mg·L -1 的TDZ溶液浸泡5、10、 15 min后置于保濕盒中，15 恒溫條件下放置2 d， 以不進(jìn)行激素預(yù)處理的材料為對(duì)照，然后按照已建 立的技術(shù)體系進(jìn)行接種，培養(yǎng)28 d后分別統(tǒng)計(jì)西 瓜未授粉子房胚狀體誘導(dǎo)率。 1.2.3 溫度預(yù)處理方式對(duì)胚狀體誘導(dǎo)率的影響 以 果柄最長(zhǎng)時(shí)的西瓜未授粉子房為材料，用0.02 mg·L -1 的TDZ溶液浸泡10 min后置于保濕盒中， 分別在10、15、20 的恒溫條件下處理1、2、3 d， 以不進(jìn)行溫度預(yù)處理的材料為對(duì)照，然后按照已建 立的技術(shù)體系進(jìn)行接種，培養(yǎng)28 d后分別統(tǒng)計(jì)西 瓜未授粉子房胚狀體誘導(dǎo)率。 1.3 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS軟件對(duì)以上各數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和 Duncans多重比較。 2 結(jié)果與分析 2.1 不同果柄長(zhǎng)度對(duì)西瓜胚狀體誘導(dǎo)率的影響 西瓜未授粉子房取樣后有一個(gè)預(yù)處理的過程， 不會(huì)立刻接種，存放過程中需要消耗部分養(yǎng)分，果 柄能夠?yàn)樽臃刻峁┎糠譅I(yíng)養(yǎng)，因此不同果柄長(zhǎng)度會(huì) 對(duì)存放后子房的生理狀態(tài)產(chǎn)生影響。試驗(yàn)結(jié)果表 明，果柄最長(zhǎng)時(shí)其胚狀體誘導(dǎo)率最高，達(dá)13.8%， 而無果柄子房的胚狀體誘導(dǎo)率僅為2.6%，帶1/2果 柄的胚狀體誘導(dǎo)率為4.4%，說明果柄長(zhǎng)度越長(zhǎng)， 西瓜胚狀體誘導(dǎo)率越高。 2.2 激素預(yù)處理方式對(duì)西瓜胚狀體誘導(dǎo)率的影響 由表1可以看出，當(dāng)TDZ濃度為0時(shí)，不同 預(yù)處理時(shí)間的胚狀體誘導(dǎo)率均處于較低水平，胚 狀體生長(zhǎng)狀況一般，總體不利于再生植株的獲得。 TDZ濃度為0.01 mg·L -1 時(shí)，相較于不用激素處 理，其胚狀體誘導(dǎo)率顯著提高，當(dāng)預(yù)處理時(shí)間達(dá) 到15 min時(shí)，誘導(dǎo)率可達(dá)6.0%。隨著TDZ濃度的 進(jìn)一步提高，胚狀體誘導(dǎo)率仍有上升的空間。在 TDZ濃度為0.02 mg·L -1 或0.03 mg·L -1 條件下， 預(yù)處理時(shí)間為10 min或15 min時(shí)，各處理之間胚 狀體誘導(dǎo)率差異不顯著且均處于較高水平，最高可 達(dá)16.7%?？梢钥闯?，與未使用激素預(yù)處理相比， 激素預(yù)處理能夠顯著提高胚狀體誘導(dǎo)率。但試驗(yàn)過 圖 1 不同果柄長(zhǎng)度的西瓜未授粉子房 彩色圖版見中國(guó)蔬菜網(wǎng)站：www.cnveg.org，下圖同。 68 新優(yōu)品種 栽培管理 本期視點(diǎn) 產(chǎn)業(yè)市場(chǎng) 病蟲防控 68 研究論文 中 國(guó) 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 程中也發(fā)現(xiàn)，TDZ濃度達(dá)0.03 mg·L -1 且激素預(yù)處 理時(shí)間為10、15 min時(shí)，雖然胚狀體誘導(dǎo)率較高， 但再生的胚狀體存在嚴(yán)重畸形，不利于再生植株的 獲得。 2.3 溫度預(yù)處理方式對(duì)西瓜胚狀體誘導(dǎo)率的影響 如表2所示，在相同預(yù)處理溫度下，不同預(yù)處 理時(shí)間之間胚狀體誘導(dǎo)率差異顯著并呈現(xiàn)出一定的 趨勢(shì)，10 或15 時(shí)隨著預(yù)處理時(shí)間的延長(zhǎng)，胚 狀體誘導(dǎo)率呈先上升后下降的趨勢(shì)；20 及室內(nèi)自 然條件下隨著預(yù)處理時(shí)間的延長(zhǎng)，胚狀體誘導(dǎo)率逐 漸下降。預(yù)處理時(shí)間相同時(shí)，隨著預(yù)處理溫度的上 升，胚狀體誘導(dǎo)率呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，在 15 預(yù)處理2 d時(shí)達(dá)到峰值，誘導(dǎo)率高達(dá)15.9%， 15 預(yù)處理時(shí)間達(dá)3 d時(shí)誘導(dǎo)率急劇下降，這可能 是由于預(yù)處理時(shí)間過長(zhǎng)子房生理狀態(tài)明顯下降造成 的。試驗(yàn)過程中還發(fā)現(xiàn)，如果西瓜子房在室內(nèi)自然 條件下放置一段時(shí)間，其胚狀體誘導(dǎo)率顯著下降， 放置時(shí)間達(dá)到3 d時(shí)其誘導(dǎo)率僅為2.8%，并且胚 狀體存在嚴(yán)重的畸形現(xiàn)象，說明西瓜未授粉子房的 生理狀態(tài)對(duì)胚狀體誘導(dǎo)率影響顯著。綜上認(rèn)為， 在15 條件下預(yù)處理2 d，能夠顯著提高春季西瓜 未授粉子房的胚狀體誘導(dǎo)率，有利于再生植株的 獲得。 3 結(jié)論 提高春季西瓜未授粉子房胚狀體誘導(dǎo)率的方 法為：摘取子房時(shí)盡量保留最長(zhǎng)果柄，然后將帶最 長(zhǎng)果柄的西瓜未授粉子房用0.02 mg·L -1 的TDZ溶 液浸泡10 min，最后將其置于15 恒溫條件下預(yù) 處理2 d，預(yù)處理完成后進(jìn)行接種培養(yǎng)，能夠顯著 改善春季西瓜未授粉子房胚狀體誘導(dǎo)率低的問題。 通過上述預(yù)處理手段，能夠?qū)⒋杭疚鞴衔词诜圩臃?的胚狀體誘導(dǎo)率從3.5%（圖2-A）提高到15.9% （圖2-B） ，雖然距秋季西瓜未授粉子房的胚狀 體誘導(dǎo)率20.2%仍有差距，但仍顯著提高了試驗(yàn) 效率。 表 1 不同激素預(yù)處理方式對(duì)西瓜胚狀體誘導(dǎo)率的影響 激素預(yù)處理方式 胚狀體誘 導(dǎo)率/% 胚狀體生 長(zhǎng)狀況 TDZ/mg·L -1 預(yù)處理時(shí)間/min 0 5 3.6 ef 一般 10 3.7 e 一般 15 3.4 f 一般 0.01 5 4.8 d 一般 10 5.9 c 良好 15 6.0 c 良好 0.02 5 10.8 b 良好 10 15.2 a 很好 15 15.3 a 有畸形 0.03 5 10.8 b 有畸形 10 15.3 a 嚴(yán)重畸形 15 16.7 a 嚴(yán)重畸形 注：表中同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在5%水平上差異顯 著，下表同。 表 2 不同溫度預(yù)處理方式對(duì)西瓜胚狀體誘導(dǎo)率的影響 溫度預(yù)處理方式 胚狀體誘 導(dǎo)率/% 胚狀體生 長(zhǎng)狀況 溫度/ 預(yù)處理時(shí)間/d 10 1 4.2 f 良好 2 11.9 b 良好 3 5.8 e 有畸形 15 1 11.8 b 良好 2 15.9 a 良好 3 6.2 d 有畸形 20 1 11.7 b 良好 2 8.4 c 良好 3 6.1 d 有畸形 室內(nèi)自然條件 1 5.9 e 一般 2 4.3 f 有畸形 3 2.8 g 嚴(yán)重畸形 圖 2 春季西瓜未授粉子房的胚狀體誘導(dǎo) A，未經(jīng)預(yù)處理的西瓜未授粉子房的胚狀體誘導(dǎo)；B，經(jīng)過預(yù)處 理的西瓜未授粉子房的胚狀體誘導(dǎo)。 A B 4 討論 相關(guān)研究證明TDZ具有細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素 的雙重功效，在誘導(dǎo)愈傷組織形成和體細(xì)胞胚分化 等一系列過程中均能發(fā)揮作用（徐曉峰和黃學(xué)林， 2003）。本試驗(yàn)使用0.02 mg·L -1 的TDZ對(duì)春季西 瓜未授粉子房進(jìn)行預(yù)處理，取得了較好的效果，能 夠顯著提高其胚狀體誘導(dǎo)率且形成的胚狀體畸形率 較低，說明TDZ有利于提高春季西瓜未授粉子房 的胚狀體誘導(dǎo)率。2，4-D是誘導(dǎo)胚狀體發(fā)生的重 69 新優(yōu)品種 栽培管理 本期視點(diǎn) 產(chǎn)業(yè)市場(chǎng) 病蟲防控 69 研究論文 中 國(guó) 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 要因素，許多植物離體胚狀體誘導(dǎo)均使用不同濃度 的2，4-D，但胚狀體形成前后，外植體在含2，4-D 的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)時(shí)間的長(zhǎng)短卻因不同作物而異。筆 者在前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，2，4-D能夠誘導(dǎo)西瓜胚狀 體的發(fā)生且誘導(dǎo)效果明確，但誘導(dǎo)一段時(shí)間后需及 時(shí)將外植體轉(zhuǎn)移到不含2，4-D的培養(yǎng)基上，步驟 相對(duì)復(fù)雜。TDZ能夠取得與2，4-D相同的誘導(dǎo)效 果且步驟簡(jiǎn)單，因此，本試驗(yàn)只對(duì)TDZ的預(yù)處理 效果進(jìn)行了研究，其他激素的誘導(dǎo)效果有待進(jìn)一步 研究。 倍性育種過程中經(jīng)常使用溫度預(yù)處理來改變 配子體的生理狀態(tài)，提高再生植株的誘導(dǎo)率，這 在西葫蘆（謝冰 等，2006） 、黃瓜（杜勝利 等， 2003） 、甜瓜（韓麗華 等，2005）等作物上已經(jīng)得 到廣泛證明。小孢子培養(yǎng)過程中一般在4 進(jìn)行預(yù) 處理，能夠取得較好的效果。大孢子培養(yǎng)時(shí)接種后 一般在35 進(jìn)行熱激處理，但處理效果卻有不同 報(bào)道。本試驗(yàn)采用15 進(jìn)行接種前預(yù)處理，取得 了較好的效果，這可能是由于春季西瓜未授粉子房 發(fā)育時(shí)所處環(huán)境溫度變化較大，最低氣溫低，從而 影響了子房的生理狀態(tài)，15 恒溫處理2 d，有效 改善了子房的生理狀態(tài)及激素水平，有利于后期誘 導(dǎo)胚狀體形成。 本試驗(yàn)有效改善了春季西瓜未授粉子房胚狀體 誘導(dǎo)率過低的問題，顯著延長(zhǎng)了試驗(yàn)可操作時(shí)間， 加速了西瓜單倍體育種進(jìn)程，試驗(yàn)結(jié)果可為我國(guó)西 瓜種質(zhì)資源創(chuàng)新、新品種選育、基因工程相關(guān)研究 提供幫助。 參考文獻(xiàn) 杜勝利，韓毅科，叢穎，魏愛民，侯鋒，陳啟民2003黃瓜離體 雌核發(fā)育的過程及其早期生化變化研究南開大學(xué)學(xué)報(bào)：自 然科學(xué)版，36（2）：27-30 韓麗華，王建設(shè)，陳貴林2005AgNO 3 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and putting it at 15 as pretreatment for 2 days could improve the induction rate of embryoid from 3.5% to 15.9% Key words：Watermelon；Spring；Unfertilized ovary；Embryoid；Induction 70 新優(yōu)品種 栽培管理 本期視點(diǎn) 產(chǎn)業(yè)市場(chǎng) 病蟲防控 70 研究論文 中 國(guó) 蔬 菜 CHINA VEGETABLES