結球甘藍小孢子培養(yǎng)條件優(yōu)化及高代自交系胚狀體誘導研究.pdf

結球甘藍小孢子培養(yǎng)條件優(yōu)化及高代自交 系胚狀體誘導研究 蘇賀楠 韓風慶 楊麗梅 莊 木 張揚勇 王 勇 李占省 方智遠 *呂紅豪 * （中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，農業(yè)部園藝作物生物學與種質創(chuàng)制重點實驗室，北京100081） 摘 要：以25份不同類型的結球甘藍為試驗材料，研究游離小孢子培養(yǎng)過程中影響胚狀體產生的因素并進行了優(yōu)化；同時 對結球甘藍高代自交系的誘導出胚情況進行了研究。結果表明：基因型是影響結球甘藍胚狀體產生的關鍵因素，參試材料中 有11份（2份一代雜種和9份高代自交系）出胚，其中一代雜種中中甘628出胚率（19.8個·蕾 -1 ）最高，高代自交系中 01-88出胚率（47.5個·蕾 -1 ）最高，極顯著高于其他參試材料；花蕾長度3.03.5 mm、花藥長度花瓣長度為32至21 時，處于單核靠邊期的小孢子比例最高，是適合小孢子培養(yǎng)的最佳取樣時期；初花期和盛花期是理想的取蕾時期；添加適量 活性炭可以極顯著提高胚誘導率。 關鍵詞：結球甘藍；游離小孢子培養(yǎng)；條件優(yōu)化；高代自交系；胚狀體誘導 株經(jīng)自然加倍或者秋水仙素誘導加倍形成純合的 雙單倍體植株（double haploid，DH）（Yuan et al.， 2015） 。DH群體是進行遺傳分析、圖譜構建和基因 定位的理想材料，而經(jīng)過鑒定獲得的優(yōu)良DH系也 為雜交育種提供了良好的材料基礎（孫繼峰 等， 2012；Lv et al.，2014a，2014b；Liu et al.，2017）。 自Lichter首次在油菜中利用小孢子培養(yǎng)獲得單倍 體植株以來，在隨后的30 a間各國學者對這一技 術進行了深入的研究，并已在多數(shù)十字花科蔬菜 包括大白菜、結球甘藍中獲得了胚狀體（Lichter， 1982；Takahata et al.，1991；Verónica et al.，2015； Mukhlesur & Monika，2016）。 在結球甘藍中，近幾年國內外學者從基因型 （Takahashi et al.，2012；Shumilina et al.，2015） 、 供體植株的生長環(huán)境、小孢子發(fā)育時期（王五宏 等，2013；王玉書 等，2015）、預處理條件（張振 超 等，2013；Shmykova et al.，2016）、培養(yǎng)條件（戴 希剛 等，2012） 、植株再生、倍性鑒定及染色體加 倍（程芳芳 等，2015；祁魏崢 等，2015）等方面 對游離小孢子培養(yǎng)技術進行了研究和改進，使得一 部分基因型的小孢子出胚率在原有基礎上得到了提 高。然而，結球甘藍小孢子培養(yǎng)仍存在一些問題： 頑固難出胚基因型材料依然較多，因而培養(yǎng)條件和 蘇賀楠，女，博士研究生，主要從事蔬菜遺傳育種研究，E-mail： 18810835083163.com *通訊作者（Corresponding authors） ：方智遠，男，院士，研究員，博 士生導師，主要從事蔬菜遺傳育種研究，E-mail：fangzhiyuancaas. cn；呂紅豪，男，助理研究員，主要從事蔬菜遺傳育種研究，E-mail： lvhonghaocaas.cn 收稿日期：2017-12-21；接受日期：2018-02-06 基金項目 ： 國 家 重 點 研 發(fā) 計 劃 項 目（2017YFD0101804， 2016YFD0100204），中國農業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程項目（CAAS- ASTIP-IVFCAAS），大宗蔬菜產業(yè)技術體系項目（nycytx-35-gw01） 結球甘藍（ Brassica oleracea L. var. capitata L.）是世界各地廣泛種植的十字花科蕓薹屬蔬菜 作物，在我國的年栽培面積已達到90萬hm 2 （楊 麗梅 等，2016） 。結球甘藍具有明顯的雜種優(yōu)勢， 目前生產上的主栽品種幾乎均為一代雜種，雜交育 種已成為結球甘藍育種的主要方式（楊麗梅 等， 2003） 。培育一代雜種，首先要獲得遺傳穩(wěn)定的高 代自交系，傳統(tǒng)育種需要78 a的時間，而利用小 孢子培養(yǎng)可以在2 a內獲得純合的育種材料，加速 自交系的選育過程；同時，隱性性狀易于表達，豐 富了育種資源。 游離小孢子培養(yǎng)技術是在花藥培養(yǎng)的基礎上 發(fā)展而來的一種單倍體誘導技術，減少了花藥壁 和絨氈層對培養(yǎng)結果的影響，培養(yǎng)出的單倍體植 30 新優(yōu)品種 栽培管理 本期視點 產業(yè)市場 病蟲防控 30 研究論文 中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 2018（4）：30 - 36 體系仍有待優(yōu)化；研究材料大多集中在一代雜種 上，關于高代自交系出胚的研究很少，因而利用差 異大的高代自交系材料構建群體、挖掘出胚相關基 因的研究鮮見報道。 本試驗擬通過對25份結球甘藍材料的花蕾長 度及形態(tài)參數(shù)、花期和活性炭等影響小孢子胚狀體 發(fā)生因素和雄配子發(fā)育過程進行研究，進一步優(yōu)化 小孢子培養(yǎng)體系；對高代自交系進行小孢子培養(yǎng)， 篩選出胚率差異較大的親本材料，為下一步構建分 離群體、挖掘出胚率相關基因和相關分子機制奠定 基礎。 1 材料與方法 1.1 試驗材料 參試材料為中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所甘 藍青花菜課題組提供的25份結球甘藍材料，包括 一代雜種5份、高代自交系20份，材料名稱及類 型詳見表1。 2016年8月20日在本所試驗基地大棚內穴盤 播種育苗，11月10日將半成株囤到陽畦越冬春化， 2017年2月25日定植到日光溫室中，常規(guī)栽培管 理；2017年4月上旬至5月上旬花期取材培養(yǎng)。 1.2 小孢子分離與培養(yǎng) 小孢子的分離與培養(yǎng)參照袁素霞（2009）和 呂紅豪（2011）的方法并加以改進。 取材：分 別取長度為3.03.5 mm的花蕾，先用70%酒精滅 菌30 s，再用7%次氯酸鈉滅菌12 min，無菌水清 洗3次，每次3 min。 游離：把滅過菌的花蕾放 入10 mL玻璃試管內，加入少量經(jīng)高溫高壓滅菌的 B5培養(yǎng)基（購自Phytotechnology Laboratories）后研 磨，使小孢子游離出來，用孔徑45 m的尼龍篩 網(wǎng)過濾到離心管中。再添加適量B5培養(yǎng)基，800 r·min -1 離心5 min，棄上清液；重復3次。加入適 量經(jīng)抽濾滅菌的NLN培養(yǎng)基（購自Phytotechnology Laboratories，pH=5.9），用血球計數(shù)板調整小孢子 懸浮液濃度為1×10 5 個·mL -1 。 培養(yǎng)：將小孢 子懸浮液分裝進規(guī)格為60 mm×15 mm的培養(yǎng)皿 中， 每個培養(yǎng)皿3 mL， 加入1滴經(jīng)高溫高壓滅菌的0.5 g·L -1 活性炭，封口并在黑暗條件下32 熱激24 h， 隨后在25 、黑暗條件下培養(yǎng)。 出胚：經(jīng)過21 d左右，小孢子出胚，統(tǒng)計出胚率（個·蕾 -1 ）。 每 份材料設置3次重復，每重復3個培養(yǎng)皿。 1.3 花蕾形態(tài)參數(shù)與游離小孢子發(fā)育時期的關系 以01-88為試驗材料觀察結球甘藍花粉配子 體發(fā)育過程。選取不同長度（2.5、3.0、3.5、4.0、 5.0 mm）的花蕾放入FAA固定液中，32 h之后進 行石蠟切片，觀察花粉配子體發(fā)育過程。 脫水： 50%、70%、85%、95%、100%乙醇，處理時間分 別為0.5 h、0.5 h、0.5 h、0.5 h、20 min。 透明： 將脫水后的材料依次置于1/2二甲苯+1/2無水乙 醇、純二甲苯、純二甲苯中，處理時間分別為0.5 h、1.0 h、0.5 h。 透蠟：將透明好的材料放入少 量二甲苯，加入石蠟蠟屑，放入37 恒溫箱，過 夜，敞口放置，使其中的二甲苯慢慢揮發(fā)。 換蠟： 第2天倒出石蠟、二甲苯混合液，在65 烘箱中 進行，加入已經(jīng)熔化的純蠟，間隔2 h換1次，共 換2次。 包埋：在60 烘箱中進行，將融化的 石蠟倒入預熱的紙盒內，將透好蠟的材料擺放在熔 蠟中，輕輕將蠟盒平移到室溫環(huán)境中，待紙盒內底 層蠟稍凝固，用預熱的鑷子將材料直立整齊地排列 在軟蠟層上，待材料固定不再飄動后，將蠟盒平移 到冷水中待完全凝固。 切片：用Leica輪轉式切 片機切片，厚度為10 m。 貼片與烘片：用玻 璃棒輕蘸1小滴粘片劑，涂抹均勻，貼片時蒸餾水 用量為12滴，烘片臺溫度設置為39 。 脫蠟： 把烘干的切片放入二甲苯中，每次5 min，共2次。 甲苯胺藍染色，顯微鏡照相觀察。設置3次重 復，每次選取3個花蕾。 以中甘628和01-88為試驗材料，分別選取 主花序，將花蕾依照長度（2.5、3.0、3.5、4.0、5.0 mm）分為5個組別，每個組別中隨機選取3個花 蕾，測定花蕾長度，計算花藥長度/花瓣長度的比 值；用小鑷子挑開花蕾，小心擠出少量花粉，均勻 鋪平于載玻片上，利用顯微鏡觀察小孢子的發(fā)育時 期與花蕾長度的相關性。 1.4 基因型對游離小孢子培養(yǎng)出胚率的影響 在相同適宜條件下（pH值為5.9的NLN培養(yǎng) 基，32 熱激24 h，0.5 g·L -1 的活性炭1滴）對 25份結球甘藍材料進行游離小孢子培養(yǎng)，21 d后 統(tǒng)計出胚率。設置3次重復，每重復3個培養(yǎng)皿。 1.5 不同花期與游離小孢子培養(yǎng)出胚率的關系 以中甘628和01-88為試驗材料，分別于初 31 新優(yōu)品種 栽培管理 本期視點 產業(yè)市場 病蟲防控 31 研究論文 中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 花期、盛花期和末花期取花蕾進行游離小孢子培養(yǎng) （pH值為5.9的NLN培養(yǎng)基，32 熱激24 h，0.5 g·L -1 的活性炭1滴） ，21 d后統(tǒng)計出胚率。設置3 次重復，每次每份材料選取3個花蕾。 初花期是指主枝的花朵開放時期（3月下旬至 4月上旬） ，盛花期是指大部分側枝頂部花朵開放 時期（4月上旬至4月下旬） ，末花期指側枝花朵 全開放至花蕾停止發(fā)育（4月下旬至5月中旬）。 1.6 活性炭濃度對游離小孢子培養(yǎng)出胚率的影響 以中甘628和01-88為試驗材料，在相同適宜 條件下（pH值為5.9的NLN培養(yǎng)基，32 熱激24 h）分別添加0.25、0.50 g·L -1 活性炭，以不添加 活性炭的處理為對照，進行游離小孢子培養(yǎng)，21 d 后統(tǒng)計出胚率。設置3次重復， 每處理3個培養(yǎng)皿。 1.7 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析， 利用Excel 2007軟件進行數(shù)據(jù)處理和圖表繪制。 2 結果與分析 2.1 基因型對結球甘藍游離小孢子培養(yǎng)出胚率的 影響 由表1和圖1可以看出，供試的25份結球甘 藍材料中，有11個基因型產生了胚狀體，都是春 甘藍圓球類型，而秋甘藍扁球類型均未出胚。一 代雜種中，中甘628為最易出胚材料，平均出胚率 高達19.8個·蕾 -1 ，極顯著高于其他品種；中甘 828、中甘23、中甘192未有胚狀體產生。在20 份高代自交系中，01-88為最易出胚材料，平均出 胚率高達47.5個·蕾 -1 ，極顯著高于其他自交系； 084、96-100-312等11份材料未出胚。 中甘628是高代自交系87-534與SG643的雜 交F 1 ，其出胚率為19.8個·蕾 -1 ，極顯著高于兩 個親本自交系的出胚率（0.3、2.6個·蕾 -1 ）； 中 甘828是高代自交系87-534與96-100-312的雜交 F 1 ，其出胚率為0個·蕾 -1 ，其親本自交系的出胚 率為0.3、0個·蕾 -1 。由此可見，不同結球甘藍材 料中胚誘導相關基因的遺傳和分子機制可能不同。 2.2 花蕾長度及形態(tài)參數(shù)與結球甘藍小孢子發(fā)育時 期的關系 由圖2可知：花粉母細胞經(jīng)過減數(shù)分裂后形成 四分體（圖2-a）；早期小孢子體積增大，顏色加深， 表1 不同基因型對結球甘藍游離小孢子培養(yǎng)出胚率的影響 試驗 編號 材料名稱 世代 類型 出胚率 個·蕾 -1 2189 中甘628 F 1 春甘藍圓球型 19.8±4.4 B 2185 中甘21 F 1 春甘藍圓球型 0.3±0.5 D 2186 中甘828 F 1 春甘藍圓球型 0 D 2187 中甘23 F 1 春甘藍圓球型 0 D 2188 中甘192 F 1 春甘藍圓球型 0 D 2003 01-88 自交6代以上 春甘藍圓球型 47.5±1.9 A 根372 79-156 自交6代以上 春甘藍圓球型 6.3±1.3 CD 根720 16C-720 自交6代以上 春甘藍圓球型 3.5±0.4 CD 2009 01-20 自交6代以上 春甘藍圓球型 3.0±0.5 CD 2026 88-62 自交6代以上 春甘藍圓球型 3.0±0.4 CD 2005 SG643 自交6代以上 春甘藍圓球型 2.6±0.3 CD 2006 15C381 自交6代以上 春甘藍圓球型 2.5±0.4 CD 2029 05C-183 自交6代以上 春甘藍圓球型 1.3±0.2 CD 2014 87-534 自交6代以上 春甘藍圓球型 0.3±0.5 CD 2002 084 自交6代以上 春甘藍圓球型 0 D 2019 96-100-312 自交6代以上 春甘藍圓球型 0 D 2028 14C552 自交6代以上 春甘藍圓球型 0 D 2031 04-45-720 自交6代以上 春甘藍圓球型 0 D 2032 04-45-721 自交6代以上 春甘藍圓球型 0 D 根563 HB-1180 自交6代以上 春甘藍圓球型 0 D 2034 04-45-796 自交6代以上 春甘藍圓球型 0 D 根535 05-570 自交6代以上 春甘藍圓球型 0 D 203 23202 自交6代以上 秋甘藍扁球型 0 D 205 8020 自交6代以上 秋甘藍扁球型 0 D 206 8282 自交6代以上 秋甘藍扁球型 0 D 注：表中同列數(shù)據(jù)后不同大寫字母表示差異極顯著 （P0.01），下表同。 圖1 部分結球甘藍游離小孢子培養(yǎng)出胚情況 a，01-88；b，79-156；c，87-534；d，中甘23。 細胞核位于中央，屬于單核早期（圖2-b） ；隨后， 細胞核移向細胞壁，花粉萌發(fā)溝清晰可見，此時呈 不明顯的三棱狀，此階段是單核靠邊期（圖2-c） ； 小孢子細胞核進行1次有絲分裂，形成1個生殖核 a c d b 32 新優(yōu)品種 栽培管理 本期視點 產業(yè)市場 病蟲防控 32 研究論文 中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 和1個營養(yǎng)核，進入雙核期（圖2-d）。 花粉的發(fā)育時期是影響小孢子最終出胚量的 關鍵因素之一，花粉發(fā)育時期的選擇與植株花蕾的 長度及形態(tài)參數(shù)密切相關，單核靠邊期即單核晚期 是結球甘藍小孢子培養(yǎng)的最適時期，此時小孢子形 態(tài)呈現(xiàn)出不明顯三棱狀。切片后在顯微鏡下觀察結 球甘藍不同大小花蕾的花粉細胞發(fā)育時期，結果 發(fā)現(xiàn)兩個不同基因型中甘628和01-88表現(xiàn)相似。 由表2可知，當花蕾長度在3.03.5 mm之間、花 藥長度花瓣長度為32至21時，處于單核靠 邊期的小孢子占67%71%，利于游離小孢子培養(yǎng) 出胚。 兩種基因型出胚率最低的取蕾時期都在末花期，分 別為0.3、0.7個·蕾 -1 ；初花期和盛花期取蕾的出 胚率極顯著高于末花期，說明初花期和盛花期是游 離小孢子培養(yǎng)的適宜時期。 2.4 活性炭濃度對結球甘藍游離小孢子培養(yǎng)出胚 率的影響 從表4可以看出，對兩種不同基因型結球甘藍 來說，在培養(yǎng)基中加入0.25、0.50 g·L -1 的活性炭 后，游離小孢子出胚率都極顯著提高，中甘628出 胚率分別達到12.0、19.8個·蕾 -1 ，01-88出胚率 分別達到35.3、47.5個·蕾 -1 ；兩種不同濃度的活 性炭處理之間游離小孢子出胚率差異未達極顯著水 平，說明適當濃度的活性炭可以提高結球甘藍小孢 子胚誘導率。 表4 不同濃度活性炭對結球甘藍游離小孢子培養(yǎng) 出胚率的影響 活性炭濃度/g·L -1 出胚率/個·蕾 -1 中甘628 01-88 0（CK） 1.0±0.2 B 6.0±0.7 B 0.25 12.0±1.1 A 35.3±2.3 A 0.50 19.8±3.8 A 47.5±1.7 A 3 結論與討論 游離小孢子培養(yǎng)是提高育種效率、豐富育種資 源的重要手段，獲得的DH群體也是進行遺傳分析、 圖譜構建和基因定位的理想材料。近年來，結球甘 藍游離小孢子培養(yǎng)技術取得了較大進展，但仍存在 一些問題，如培養(yǎng)體系不夠完善、胚誘導的相關分 子機制尚不明確等，阻礙了小孢子培養(yǎng)技術在育種 中的進一步應用。 在培養(yǎng)體系方面，研究表明影響小孢子培養(yǎng)成 胚的關鍵因素包括基因型、取蕾時期、活性物質等。 基因型是影響小孢子培養(yǎng)出胚的關鍵因素，不同基 因型之間出胚率差異較大，供體植株的基因型不僅 影響小孢子的產胚率，而且也影響胚的質量（王超 楠 等，2010；顧祥昆 等，2013） 。以往有關研究著 重介紹了一代雜種的出胚率，桑玉芳等（2007）比 較分析了19個結球甘藍一代雜種游離小孢子的出 胚情況，結果發(fā)現(xiàn)出胚率1個·蕾 -1 的品種只有 10個；關于自交系材料研究較少，楊安平等（2009） 分別用25份結球甘藍F 1 及其50份親本，產胚困 圖2 01-88花粉配子體發(fā)育途徑 a，配子體時期；b，單核早期；c，單核靠邊期；d，雙核早期。 表2 結球甘藍不同長度花蕾中單核靠邊期小孢子的比例 花蕾長度/mm 花藥長度花 瓣長度 單核靠邊期比例/% 中甘628 01-88 2.5 2.51 40 A 40 A 3.0 21 67 B 71 B 3.5 32 68 B 70 B 4.0 2.52 60 B 62 B 5.0 23 40 A 40 A 表3 取蕾時期對結球甘藍游離小孢子培養(yǎng)出胚率的影響 取蕾時期 出胚率/個·蕾 -1 中甘628 01-88 初花期 19.8±3.8 A 20.0±0.7 AB 盛花期 7.0±0.7 AB 47.5±1.7 A 末花期 0.3±0.1 C 0.7±0.1 C 2.3 不同花期對結球甘藍游離小孢子培養(yǎng)出胚率 的影響 由表3可知，兩種不同基因型的結球甘藍出胚 率最高時的取蕾時期不同，其中一代雜種中甘628 在初花期的出胚率最高，達19.8個·蕾 -1 ，自交系 01-88在盛花期的出胚率最高，達47.5個·蕾 -1 ； a c d b 33 新優(yōu)品種 栽培管理 本期視點 產業(yè)市場 病蟲防控 33 研究論文 中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 難的22份結球甘藍F 1 及其相應的F 2 ，1份產胚能 力強的結球甘藍與22份產胚困難材料的正、反交 后代，在同等條件下進行小孢子培養(yǎng)，結果發(fā)現(xiàn)結 球甘藍F 1 較其親本產胚能力強，對產胚困難的結 球甘藍F 1 ，以其F 2 為試材可誘導產胚或提高胚產 量，用產胚能力強的結球甘藍作親本與產胚困難的 材料雜交，正、反交均能明顯提高產胚困難材料 的產胚能力。本試驗以25份不同基因型結球甘藍 為試材（其中有20份高代自交系） ，在相同適宜培 養(yǎng)條件下進行游離小孢子培養(yǎng)，結果發(fā)現(xiàn)共有11 個基因型（2份一代雜種和9份高代自交系）產生 了胚狀體，且不同材料之間小孢子出胚率差異顯 著，中甘628的出胚率極顯著高于兩個親本自交系 87-534與SG643，可見以產胚率較高的結球甘藍作 親本與產胚困難的材料雜交，能明顯提高雜交后代 的產胚能力，這與前人的研究結果相似。 在十字花科蔬菜花藥和游離小孢子培養(yǎng)中，單 核期和雙核早期通常認為是小孢子最適培養(yǎng)的時期 （星曉蓉，2011） ，而不同花蕾的大小對應著小孢 子不同的發(fā)育時期，選擇最佳花蕾長度非常關鍵。 因此，本試驗采用石蠟切片技術對結球甘藍配子體 發(fā)育進行了詳細觀察，分別觀察到四分體時期、單 核早期、單核晚期、雙核期，并明確了關鍵時期（單 核期和雙核早期）與花蕾長度和花藥、花瓣長度比 值之間的對應關系，為選取取樣最適時期的花蕾提 供了細胞學依據(jù)。曾愛松等（2015）利用DAPI染 色對甘藍花粉發(fā)育途徑進行觀察，發(fā)現(xiàn)6個品種 的花蕾長度基本在3.54.5 mm范圍內處于單核靠 邊期的小孢子比例最高。本試驗對2個易出胚的甘 藍材料進行觀察，發(fā)現(xiàn)花蕾長度在3.03.5 mm之 間，且花藥長度花瓣長度為32至21時，處 于單核靠邊期的小孢子比例最高，該結果中適宜的 花蕾長度較前人研究中的稍短，可能與基因型不同 有關。 取蕾時期也是影響結球甘藍小孢子出胚率的重 要因素之一。馮輝等（2007）對羽衣甘藍的研究發(fā) 現(xiàn)，盛花期是最適宜的取蕾時期；曾愛松等（2010） 研究認為，結球甘藍取蕾時期對易出胚和難出胚的 材料影響不一致，對于易出胚材料，花期對胚胎發(fā) 生影響不大，出胚率都基本穩(wěn)定，對于難出胚材料， 開花初期至盛花中期取樣培養(yǎng)易獲得成功，而末花 期很少有胚狀體產生。本試驗利用2個易出胚基因 型進行花期對小孢子培養(yǎng)出胚率影響的研究，結果 表明2個基因型出胚率最高的花期不同，一代雜種 中甘628在初花期出胚率最高，達19.8個·蕾 -1 ， 高代自交系01-88在盛花期出胚率最高，達47.5 個·蕾 -1 ，二者出胚率最低時期一致。 在培養(yǎng)基中添加一些活性成分會影響小孢子的 產胚能力。蔣武生等（2008）在大白菜游離小孢子 培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)添加活性炭（0.5 mg·L -1 ）較未添加活 性炭的對照培養(yǎng)效果好，兩個處理小孢子胚誘導率 相差417倍；韓陽等（2006）在大白菜游離小孢 子培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)100、200 mg·L -1 活性炭對大白菜小 孢子的胚胎發(fā)生有抑制作用。本試驗結果表明，加 入0.25、0.50 g·L -1 活性炭均有利于結球甘藍胚狀 體發(fā)生，這可能與活性炭能吸附培養(yǎng)過程中的部分 有害物質有關。 目前，關于小孢子培養(yǎng)出胚相關分子機制的研 究很少，Malik等（2007）通過構建cDNA文庫從 甘藍型油菜0 h（晚無核到早期雙核小孢子）、3 d（32 熱激處理誘導小孢子） 、5 d（分裂小孢子）和7 d （胚性小孢子）小孢子中分離出來 LEC1、LEC2、 BBM，這3個基因在小孢子胚胎形成時起著重要的 作用。Kitashiba等（2016）利用高出胚大白菜品種 Ho-Me和低出胚大白菜品種CR-Seiga構建小孢子 群體，利用偏分離確定與小孢子胚胎發(fā)生相關的基 因位點，確定了3個與小孢子培養(yǎng)胚產量相關物理 位置。然而在結球甘藍中還未見與小孢子胚胎發(fā)生 相關的基因及分子機制研究，本試驗得到的高、低 出胚自交系材料為下一步開展甘藍小孢子培養(yǎng)出胚 機制的研究打下了基礎。 本試驗從基因型、取蕾時期、活性物質等方面 進一步探討和優(yōu)化了結球甘藍小孢子培養(yǎng)的條件； 獲得的純合DH系為育種提供了材料；獲得的出胚 率差異大的自交系也為下一步構建群體、挖掘胚誘 導相關基因及分子機制的研究做好了鋪墊，進一步 的工作正在開展中。 參考文獻 程芳芳，張恩慧，楊安平，程永安，許忠民，董韓，霍柳青.2015. 甘藍小孢子單倍體植株加倍技術探討.西北農林科技大學學 報：自然科學版，43（6）：167-173. 戴希剛，施雪萍，包滿珠.2012.基因型與培養(yǎng)條件對羽衣甘藍小 34 新優(yōu)品種 栽培管理 本期視點 產業(yè)市場 病蟲防控 34 研究論文 中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 孢子胚胎發(fā)生的影響.植物生理學報，48（11） ：1113-1119. 馮輝，姜鳳英，馮建云，王超楠.2007.羽衣甘藍游離小孢子培養(yǎng) 技術研究及應用.園藝學報，34（4）：1019-1022. 顧祥昆，李菲，張淑江，章時蕃，張慧，孫日飛.2013.芥菜游離 小孢子培養(yǎng)技術研究.中國蔬菜，（12）：23-30. 韓陽，葉雪凌，馮輝.2006.大白菜小孢子培養(yǎng)影響因素研究.中 國蔬菜，（7）：16-18. 蔣武生，姚秋菊，張曉偉，原玉香，耿建峰.2008.活性炭和振 蕩培養(yǎng)對提高大白菜胚誘導率的影響.中國瓜菜，21（4） ： 1-3. 呂紅豪.2011.甘藍枯萎病抗源篩選和抗性遺傳研究碩士論 文.北京：中國農業(yè)科學院. 祁魏崢，頡建明，郁繼華，康俊根.2015.甘藍游離小孢子培養(yǎng)及 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