木霉菌對土壤微生物多樣性及草莓生長和發(fā)病的影響.pdf

王 寧 ， 劉 銅 ， 靳亞忠 ， 等 木霉菌對土壤微生物多樣性及草莓生長和發(fā)病的影響 J 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) ， 2018， 46( 18) : 108 112doi: 1015889/j issn1002 1302201818027木霉菌對土壤微生物多樣性及草莓生長和發(fā)病的影響王 寧1， 劉 銅2， 靳亞忠2， 咸洪泉1( 1 青島農(nóng)業(yè)大學(xué) ， 山東青島 266109; 2 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) ， 黑龍江大慶 163319)摘要 : 在草莓苗期施用木霉菌可濕性粉劑后 ， 通過對土壤微生物基因進行高通量測序 ， 研究土壤微生物多樣性變化 。結(jié)果表明 ， 木霉菌對細菌的影響主要表現(xiàn)為假單胞菌屬 ( Pseudomonas) 數(shù)量明顯增多 ; 對真菌的影響主要表現(xiàn)為頭梗霉屬 ( Cephaliophora) 、赤霉菌屬 ( Gibberella) 和毛殼菌屬 ( Chaetomium) 數(shù)量明顯減少 ， 四枝孢屬 ( Tetracladium) 數(shù)量明顯增多 ?？傮w看出 ， 施用木霉菌可濕性粉劑對細菌多樣性的影響較小 ， 對真菌多樣性的影響較大 ， 會使真菌多樣性指數(shù)明顯降低 。此外 ， 施入木霉可濕性粉劑對草莓植株具有明顯的促生長作用 ， 并對草莓灰霉病有很好的預(yù)防和治療作用 。關(guān)鍵詞 : 木霉 ; 土壤微生物 ; 多樣性 ; 高通量測序中圖分類號 : S15436; S668401 文獻標志碼 : A 文章編號 : 1002 1302( 2018) 18 0107 05收稿日期 : 2017 03 30基金項目 : 國家科技基礎(chǔ)性工作專項 ( 編號 : 2014FY120900) ; 山東省重點研發(fā)計劃 ( 編號 : 2018GNC110024) ; 山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新項目 ( 編號 : 2217003) 。作者簡介 : 王 寧 ( 1991) ， 女 ， 山東萊蕪人 ， 碩士研究生 ， 主要從事農(nóng)業(yè)微生物方面的研究 。E mail: ningwang_rain163 com。通信作者 : 咸洪泉 ， 博士 ， 教授 ， 主要從事植物病害生物防治工作 。E mail: hqxian qau edu cn。木霉菌是優(yōu)良的生防真菌 ， 在應(yīng)用真菌防治土傳病害的研究中 ， 應(yīng)用最廣泛的真菌殺菌劑便是木霉菌 1。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)失衡是造成土傳病害發(fā)生的主要原因 2 3， 其多樣性高低是衡量土壤健康與否的一項重要指標 4。施用木霉菌后 ， 通過對土壤微生物多樣性產(chǎn)生影響來達到防治病害 、改良土壤的作用 ， 因此 ， 研究土壤微生物多樣性意義重大 。目前微生物多樣性的研究方法多為活菌培養(yǎng) ， 局限在部分微生物總體數(shù)量研究 ， 對種類的研究比較少 ， 而土壤中的大多數(shù)微生物是無法進行培養(yǎng)的 ， 可培養(yǎng)率只有 0 1% 1 0% 5 6。高通量測序具有無需培養(yǎng) 、能夠客觀還原菌群結(jié)構(gòu)和數(shù)據(jù)量大等優(yōu)點 7， 近年來 ， 高通量測序技術(shù)不斷發(fā)展 ， 尤其是第二代測序方法 ， 即 Illumina 454 和 SOLiD Ion Torrent 具有諸多優(yōu)點 8 10。這些測序平臺最大數(shù)據(jù)產(chǎn)出通量高 ， 在土壤微生物多樣性的研究中可以獲得豐富的信息 11 12。因此 ， 筆者試圖通過對土壤微生物基因組進行高通量測序 ， 研究木霉菌施用后對土壤微生物多樣性的影響 ， 為進一步揭示木霉菌和土壤微生物多樣性之間的關(guān)系提供依據(jù) 。1 材料與方法11 試驗材料供試菌劑為青島農(nóng)業(yè)大學(xué)研發(fā)的木霉菌可濕性粉劑 ， 棘孢木霉 ( Trichoderma asperellum) 的孢子濃度為 1 ×109CFU/g，草莓品種為紅顏 。12 試驗方法121 田間試驗設(shè)計 試驗在黑龍江省大慶市薩爾圖區(qū)春雷農(nóng)場塑料大棚內(nèi)進行 ， 木霉菌可濕性粉劑于苗期施用 。設(shè)木霉菌可濕性粉劑 、對照 2 個處理 ， 小區(qū)面積為 002 hm2， 共3 次重復(fù) 。木霉菌可濕性粉劑處理為將木霉菌可濕性粉劑稀釋 300 倍進行灌根 ， 灌根量為 300 mL/株 ， 對照用等體積的水灌根 。灌根時間為 2016 年 11 月 4 日 ， 21 d 后采用對角線五點取樣法取草莓根際土 。122 土壤微生物測序 微生物多樣性研究主要基于編碼核糖體 NA 的核酸序列 ， 其中細菌多樣性研究主要是基于16S rDNA V3 + V4 區(qū) ， 真菌多樣性研究主要基于內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) ITS1 區(qū) 。提取樣品總 DNA， 細菌 V3 + V4 擴增采用的引物如 下 : F， 5' AACTYCTACGGAGGCWG 3' ， 5' GACTACNVGGGTATCTAATCC 3'。真菌 ITS1 擴增引物如下 : ZF， 5' AACCTGCGGAAGGATCATT 3' Z， 5' GACCAAGAGATCCTTG 3'。進行 PC 擴增并對其產(chǎn)物進行純化 、定量和均一化形成測序文庫 ， 對于建好的文庫先進行文庫質(zhì)檢 ， 質(zhì)檢合格的文庫用 Illumina HiSeq 2500 進行測序 。測序由北京百邁客生物科技有限公司完成 。123 信息分析流程 利用雙末端測序 ( paired end) 的方法 ， 構(gòu)建小片段文庫進行測序 。通過對 reads( 讀長 ) 拼接過濾 ， 得到優(yōu)化序列 ( tags) 。將優(yōu)化序列進行操作分類單元( operational taxonomic units， 簡稱 OTUs) 聚類 ， 并進行物種注釋及豐度分析 ， 以揭示樣品的物種構(gòu)成 。進一步進行 多樣性分析 ( alpha diversity) ， 研究單個樣品內(nèi)部的物種多樣性 ， 統(tǒng)計各樣品在 97% 相似度水平下的 Ace、Chao1、Shannon 及Simpson 指數(shù) 。124 草莓生長指標測定 施用木霉菌可濕性粉劑 50 d后 ， 測定單株葉片數(shù)及單張葉面積 ， 測定數(shù)量為 10 株 。單張葉面積的測定參考喬寶營等的方法 13。125 草莓灰霉病的調(diào)查 施藥后在生育期內(nèi)定期觀測連作草莓土傳病害的發(fā)生情況 ， 主要調(diào)查整個試驗處理草莓灰霉病的病株數(shù) ， 并參照朱虹等方法計算防效 14。2 結(jié)果與分析21 樣品測序結(jié)果評估通過數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件處理各階段樣品序列數(shù) ， 評估數(shù)據(jù)質(zhì)801 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018 年第 46 卷第 18 期量 。各樣品測序數(shù)據(jù)評估結(jié)果如表 1、表 2 所示 。稀釋性曲線 ( rarefaction curve) 用于驗證測序數(shù)據(jù)量是否足以反映樣品中的物種多樣性 ， 并間接反映樣品中物種的豐富程度 15。由圖 1 可以看出 ， 在一定范圍內(nèi) ， 隨著測序數(shù)的增多 ， 若曲線表現(xiàn)為急劇上升 ， 則表示群落中有大量物種被發(fā)現(xiàn) ; 當曲線趨于平緩時 ， 則表示此環(huán)境中的物種并不會隨著測序數(shù)量的增加而明顯增多 。稀釋曲線可以作為對各樣本測序表 1 樣品細菌測序數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計處理雙端 reads 數(shù)( 個 )原始序列數(shù) ( 個 )優(yōu)化序列數(shù) ( 個 )優(yōu)化序列占比( %)T180 415 76 297 63 698 7920T280 509 76 422 64 196 7974T379 583 75 428 63 206 7942CK179 948 75 396 63 513 7941CK279 916 75 605 63 254 7915CK379 809 75 656 63 652 7976表 2 樣品真菌測序數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計處理雙端 reads 數(shù)( 個 )原始序列數(shù) ( 個 )優(yōu)化序列數(shù) ( 個 )優(yōu)化序列占比( %)T180 118 51 337 49 572 6187T280 192 53 576 51 069 6368T380 137 52 327 50 640 6319CK179 593 50 969 46 457 5837CK279 836 56 269 52 957 6633CK380 090 53 943 50 834 6347量是否充分的判斷 ， 如果曲線急劇上升 ， 表明測序量不足 ， 需要增加序列數(shù) ; 反之 ， 則表明樣品序列充分 ， 可以進行數(shù)據(jù)分析 。樣品稀釋曲線分別在測序數(shù)為 10 000、20 000 條處逐漸趨向平坦 ， 而表 1 顯示 ， 細菌的優(yōu)化測序數(shù)量超過 60 000 條 ，表 2 顯示 ， 真菌的優(yōu)化序列超過 40 000 條 ， 說明樣品序列充分 ， 測序數(shù)量合理 。22 OTU 劃分結(jié)果6 個樣品測序共獲得 479 966 對 reads， 雙端 reads 拼接 、過濾后共產(chǎn)生 301 529 條 tags， 平均每個樣品產(chǎn)生 43 076tags。根據(jù)不同的相似度水平 ， 對所有序列進行 OTU 劃分 ， 在一般情況下 ， 如果序列之間的相似性高于 97% 就可以把它定義為 1 個 OTU， 每個 OTU 對應(yīng) 1 種代表序列 16。使用 QIIME( version 180) 軟件中的 UCLUST 對 tags 在 97%的相似度水平下進行聚類 ， 獲得 OTU， 并基于 Silva( 細菌 ) 和 UNITE( 真菌 ) 分類學(xué)數(shù)據(jù)庫對 OTU 進行分類學(xué)注釋 。由表 3 看出 ， 各處理組和對照組細菌的總種類數(shù)變化非常小 ， 而真菌種類的數(shù)量差異較大 ， 處理組較對照組真菌種類總數(shù)明顯減少 ， 降低了 1757%。表 3 通過聚類得到的不同處理土壤中的 OTU 數(shù)量菌類CK 的 OTU 數(shù) ( 個 ) 處理的 OTU 數(shù) ( 個 )CK1CK2CK3 平均T1T2T3 平均總 OTU 數(shù)( 個 )細菌 1 247 1 146 1 260 1 217 1 197 1 241 1 210 1 216 1 391真菌 347 233 310 296 220 295 219 244 45923 屬水平豐度變化由圖 2 可以看出 ， 細菌屬水平的豐度變化表現(xiàn)如下 : 在土壤中 ， 特呂珀菌屬 ( Truepera) 、Chryseolinea、藤黃單胞菌屬( Luteimonas) 、鐵礦沙單胞菌屬 ( Arenimonas) 、鞘鞍醇單胞菌屬 ( Sphingomonas) 、冷 菌 屬 ( Algoriphagus) 和 熱 單 胞 菌 屬( Thermomonas) 豐度較高 ， 處理組和對照組相比沒有明顯變化 。處理組的假單胞菌屬 ( Pseudomonas) 豐度所占比例比對照增加 458 百分點 。假單胞菌屬是土壤中病原菌的拮抗菌 ，其種類和數(shù)量增多有利于土壤健康 17。由圖 3 可以看出 ， 真菌屬水平豐度的變化表現(xiàn)如下 : 鐮刀菌屬 ( Fusarium) 在 T3處理中豐度占比 2 41%， T3處理中其他種類真菌數(shù)量較少 ， 鐮刀菌占據(jù)絕對優(yōu)勢 ， 與往年 T3處理是根腐病嚴重區(qū)有關(guān) 。大棚內(nèi)有相同根腐病發(fā)生區(qū)的土壤中 ， 鐮刀菌豐度占比達 3 35%， 木霉菌處理后下降 28 06 百分點 。豐度占比前 10 的頭梗霉屬 ( Cephaliophora) 、赤霉菌屬( Gibberella) 、毛殼菌屬 ( Chaetomium) 相對豐度明顯減少 ， 分別降低 24520、32253、3846 百分點 ， 羽蘚屬 ( Tetracladium)相對豐度明顯增多 ， 增加 34829 百分點 。毛殼菌廣泛存在于土壤中 ， 它可以有效降解纖維素和有機物 ， 對微生物產(chǎn)生拮抗作用 ， 是廣泛應(yīng)用的生防菌 18。而木霉菌和毛殼菌互相拮抗 ， 所以會造成毛殼菌豐度的減少 19。24 物種豐度聚類熱圖Heatmap 是以顏色梯度來代表數(shù)據(jù)矩陣中數(shù)值的大小并根據(jù)物種或樣品豐度相似性進行聚類的一種圖形展示方式 。901江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018 年第 46 卷第 18 期將高豐度和低豐度的物種分塊聚集 ， 通過顏色梯度及相似程度來反映多個樣品群落組成的相似性和差異性 。在熱圖聚類結(jié)果中 ， 顏色代表物種豐度 ; 縱向聚類表示不同物種在各樣品間豐度的相似情況 ， 2 個物種間距離越近 ， 枝長越短 ， 說明這 2個物種在各樣品間的豐度越相似 ; 橫向聚類表示不同樣品的各物種豐度的相似情況 ， 與縱向聚類一樣 ， 2 個樣品間距離越近 ， 枝長越短 ， 說明這 2 個樣品的各物種豐度越相似 。從圖 4 可以看出 ， 木霉菌制劑處理的土樣真菌豐度明顯降低 ， 尤其是處理 1 和處理 3。處理 2 和對照 2 橫向聚類豐度相近 ， 縱向聚類豐度差異較大 。頭梗霉屬 、赤霉菌屬等一些土壤致病菌明顯減少 ， 而圓酵母屬 ( Torula) 、摩西管柄囊霉( Funneliformis) 、羽蘚屬 ( Tetracladium) 豐度增加 ， 其中摩西管柄囊霉和羽蘚屬均是菌根真菌 ， 對土壤健康的保持非常重要 。21 d 后木霉菌的數(shù)量會明顯降低 。25 Alpha 多樣性分析Alpha 多樣性有 Chao1、Ace、Shannon、Simpson 等多種衡量指標 20。其中 Chao1 和 Ace 指數(shù)能簡單地反映群落中物種的數(shù)量 ， 而不表示群落中每個物種的豐度信息 。Shannon和 Simpson 指數(shù)用于衡量群落多樣性 ， 受樣品群落中物種豐度和物種均勻度的影響 。Chao1、Ace、Shannon 指數(shù)越大 ，Simpson 指數(shù)越小 ， 說明樣品的物種多樣性越高 21。另外 ， 本研究還統(tǒng)計了樣本文庫的覆蓋率 ( Coverage) ， 其數(shù)值越高 ， 則表明樣本中序列被測出的概率越高 ， 而沒有被測出的概率越低 。該指數(shù)可以反映測序結(jié)果是否能夠代表樣本中微生物的真實情況 。從表 4、表 5 可以看出 ， 經(jīng)過木霉菌處理后 ， 土壤微生物多樣性指數(shù)整體上變低 ， 細菌多樣性指數(shù)變化不大 ， Ace 和Shannon 指數(shù)變化較小 ， Chao1 和 Simpson 指數(shù)略微下降 。真菌的多樣性指數(shù)明顯降低 ， 對照 Ace、Chao1、Shannon 指數(shù)分別比處理增加 1851%、1881、3103%; 對照 Simpson 指數(shù)比處理降低 5096%。分析原因 ， 可能是由于木霉菌對細菌的拮抗性較小 ， 主要拮抗真菌 。26 木霉制劑對草莓植株生長及灰霉病發(fā)生的影響施入可濕性粉劑后 ， 分別在生育期內(nèi)進行草莓葉片數(shù)量 、面積測定 。表 6 結(jié)果表明 : 處理組的草莓葉片數(shù)量 、葉面積均比對照組明顯增加 。施藥后 50 d 時 ， 處理組葉片數(shù)量 、葉面積分別比對照組增加 10 78%、10 94%， 對草莓灰霉病的相對防效達 65%。結(jié)果說明 ， 施入木霉菌對草莓植株具有明顯的促生長作用 ， 并對草莓灰霉病有很好的預(yù)防和治療作用 。3 結(jié)論與討論本試驗采用土壤宏基因組高通量測序的方法研究木霉菌制劑施用后對土壤微生物多樣性的影響 ， 結(jié)果表明 ， 施用木霉菌對土壤中細菌多樣性影響較小 ， 但會使真菌多樣性明顯降低 。木霉菌對細菌多樣性的影響主要表現(xiàn)為假單胞菌屬數(shù)量明顯增多 ; 對真菌多樣性的影響主要表現(xiàn)為頭梗霉屬 、赤霉菌屬和毛殼菌屬等數(shù)量明顯減少 ， 酵母菌 、羽蘚屬等數(shù)量明顯增多 。木霉菌的施用會造成很多病原菌含量減少 ， 也會造成一些有益菌含量減少 ， 從而重新塑造土壤的微生態(tài)系統(tǒng) ， 間接改良土壤 ， 增強植株長勢 ， 并減輕灰霉病等土傳病害的發(fā)生程度 22。馬建華等報道 ， 在土壤中施入深綠木霉后細菌增長速度緩慢 ， 而真菌數(shù)量顯著降低 23。古麗君等研究發(fā)現(xiàn) ， 施入深綠木霉 17 d 后 ， 真菌的數(shù)量比對照減少了 4 × 103CFU/g， 土壤中細菌的數(shù)量增加了 1 27 × 1010CFU/g， 放線菌數(shù)量沒有明顯變化 24。另有報道顯示 ， 木霉菌和假單胞菌屬可以協(xié)同作用 ， 從而提高生防效果 25。毛殼菌屬是優(yōu)良的生防菌 ， 但木霉菌施用后會造成其數(shù)量下降 ， 已有報道顯示兩者互相拮抗 19。有關(guān)木霉菌在土壤中存活時間的問題 ， 當前研究結(jié)果不一 ， 康萍芝等研究發(fā)現(xiàn) ， 施用木霉菌后 11 d， 木霉菌含量達到高峰 ， 之后開始降低 ， 55 d 后土壤中幾乎檢測不到木霉菌 26。杜嬋娟等發(fā)現(xiàn) ， 施用木霉菌后 35 d， 木霉菌含量達到高峰 ， 之后開始下降 27。古麗君等發(fā)現(xiàn) ， 木霉在施入 25 d 時 ， 相對含量達到最低值 24。本研究發(fā)現(xiàn) ， 施用木霉制劑 21 d 后根際土壤中木霉菌含量已經(jīng)很低 ， 其原因有待進一步研究 。土壤微生物多樣性是衡量土壤健康與否的重要指標 。木011 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018 年第 46 卷第 18 期表 4 細菌 Alpha 多樣性指數(shù)統(tǒng)計處理OTU 數(shù)( 個 )Ace指數(shù)Chao1指數(shù)Simpson指數(shù)Shannon指數(shù)覆蓋率( %)CK11 247 1 30926 1 31866 0003 5 637 9920CK21 146 1 19368 1 19596 0007 7 599 9947CK31 260 1 31526 1 32500 0003 0 640 9929CK 平均 1 218 1 27273 1 27987 0004 7 625 9932T11 197 1 26894 1 28314 0005 1 610 9928T21 241 1 29536 1 32926 0008 0 612 9937T31 210 1 26799 1 28306 0004 0 625 9936處理平均 1 216 1 27743 1 29849 0005 7 616 9934霉菌的施用會改變土壤中的微生態(tài)系統(tǒng) ， 往往使一些土傳病害真菌種類和數(shù)量減少 ， 而土壤中有許多真菌往往是重要的病原菌 28， 從而使土壤有益菌和病原菌保持一種動態(tài)平衡 ，達到抑制病害發(fā)生和促進作物生長的目的 。參考文獻 : 1 楊依軍 ， 王 勇 ， 楊秀榮 ， 等 拮抗木霉菌在生物防治中的作用 J 天津農(nóng)業(yè)科學(xué) ， 2000， 6( 3) : 29 33111江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018 年第 46 卷第 18 期表 5 真菌 Alpha 多樣性指數(shù)統(tǒng)計處理OTU 數(shù)( 個 )Ace指數(shù)Chao1指數(shù)Simpson指數(shù)Shannon指數(shù)覆蓋率( %)CK1347 38018 36862 0076 0 352 998 7CK2233 24991 27019 0133 1 259 9991CK3310 31748 31864 0159 1 301 9995CK 平均 297 31586 31915 0122 7 304 9991T1220 24164 24555 0162 0 240 9990T2295 31236 31484 0157 9 286 9992T3219 24558 24546 0430 8 171 9992處理平均 245 26653 26862 0250 2 232 9991表 6 木霉制劑對草莓生長和灰霉病發(fā)生的影響 ( 施藥后 50 d)處理平均葉片數(shù)量( 張 /株 )平均葉面積( cm2/張 )施后病情指數(shù)防效( %)木霉菌 113 71 144 65對照 102 64 411 2 ao S， Chan Y， Bugler Lacap D C， et al Microbial diversity in soil，sand dune and rock substrates of the Thar monsoon desert， India J Indian Journal of Microbiology， 2016， 56( 1) : 35 45 3 Garbeva P， van Veen J A， van Elsas J D Microbial diversity in soil:selection microbial populations by plant and soil type and implicationsfor disease suppressiveness J Annual eview of Phytopathology，2004， 42( 1) : 243 270 4 Xie Y， Fan J， Zhu W， et al Effect of heavy metals pollution on soilmicrobial diversity and bermudagrass genetic variation J Frontiersin Plant Science， 2016， 7( 1) : 755 5 Pace N A molecular view of microbial diversity and the biosphere J Science， 1997， 276( 5313) : 734 740 6 Torsvik V， Goksyr J， Daae F L High diversity in DNA of soilbacteria J 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