番茄褪綠病毒在湖南省首次發(fā)生_王雪忠.pdf

番茄褪綠病毒在湖南省首次發(fā)生王雪忠1，2張戰(zhàn)泓3鄭立敏2唐 鑫2史曉斌2劉 勇1，2 *（1湖南大學研究生院隆平分院，湖南長沙 410125；2湖南省植物保護研究所，湖南長沙 410125； 3湖南省蔬菜研究所，湖南長沙 410125）摘 要：2016 年 7 月在湖南省蔬菜病害調查中發(fā)現，4 種茄科蔬菜表現出葉脈間褪綠、葉片黃化等癥狀，疑似被番茄褪綠病毒（ Tomato chlorosis virus，ToCV）感染，同時葉片背面聚集了大量煙粉虱。采用 ToCV 熱激蛋白（heat shockprotein70，HSP70）序列的特異性引物對采集的番茄、茄子、辣椒、馬鈴薯樣品和煙粉虱樣品進行 RT-PCR 檢測，均擴增出目標條帶，且擴增序列與北京番茄 ToCV 分離物（KC887999.1）部分序列相似度為 99.0%，確認采集樣品被 ToCV 感染。4 種茄科蔬菜ToCV 的感染率達 70%100%；發(fā)病葉片上煙粉虱的帶毒率為 66.7%87.5%；鑒定出煙粉虱的生物類型為 MED 煙粉虱。這是湖南省首次確認該病毒，需要引起關注和加強防范。關鍵詞：番茄褪綠病毒；茄科蔬菜；煙粉虱等 6 個 科 植 物（Wintermantel &Wisler，2006；Landeo-Ríos etal.，2015），其 中對番茄造成的產量損失最為顯著。ToCV 只能通過韌皮部侵染的方式侵染植物，由媒介昆蟲以半持久的方式傳播，其媒介昆蟲包括煙粉虱（ Bemisia tabaci）、溫室白粉虱（ Trialeurodes vaporariorum）、銀葉粉虱（ B. argentifolii）和紋翅粉虱（ T. abutilonea），其中以煙粉虱的傳播能力最為高效（Wintermantel &Wisler，2006）。目前國內外暫未獲得ToCV的抗性番茄品種（Orfanidou etal.，2016） ，又因媒介昆蟲反復發(fā)生，雜草清理具有難度，導致 ToCV 防治存在困難。2016 年 7 月對湖南省蔬菜研究所基地進行病害調查發(fā)現，番茄、茄子、辣椒和馬鈴薯的葉片出現褪綠黃化、葉脈仍然保持綠色等疑似 ToCV 感染的癥狀，同時在病葉上發(fā)現了大量的煙粉虱。故分別采集癥狀明顯的番茄、茄子、辣椒和馬鈴薯葉片樣品，利用 ToCV 特異性引物進行分子鑒定，并檢測發(fā)病植株上煙粉虱攜帶 ToCV 的帶毒率以及煙粉虱的生物類型。1 材料與方法1.1 樣本采集在湖南省蔬菜研究所基地采集疑似感染 ToCV的番茄、茄子、辣椒和馬鈴薯植株葉片各 20 份，王雪忠，女，碩士研究生，專業(yè)方向：植物病毒與昆蟲互作，E-mail：1401163317qq.com* 通訊作者（Corresponding author）： 劉勇，研究員，博士生導師，專業(yè)方向：蔬菜病毒病防治，E-mail：haoasliu163.com收稿日期：2018-05-09；接受日期：2018-07-11基金項目 ： 國 家 自 然 科 學 基 金 項 目（31571981，31571982，31672003），湖南省科技計劃項目（2016RS2019）番茄褪綠病毒（ Tomato chlorosis virus，ToCV）屬于長線形病毒科（Closteroviridae）毛形病毒屬（ Crinivirus），于 1998 年在美國佛羅里達州首次發(fā)現（Wisler etal.，1998）。截 至目前，ToCV 已在我國臺灣、北京、山東、天津、河北和河南等地發(fā)生流行，對各地番茄生產造成了嚴重影響（Tsai etal.，2004；Zhao etal.，2013；劉永 光 等，2014；周濤 等，2014；胡京 昂 等，2015；孫國 珍 等，2015）。ToCV 侵染的典型癥狀是植株下部葉片先觀察到葉脈間黃化褪綠。發(fā)病初期葉片除葉脈仍保持綠色外，脈間變黃，葉片變厚；發(fā)病中期，整個葉片由邊緣向內開始出現壞死斑；發(fā)病后期，整個植株死亡，果實受到嚴重影響（趙黎明，2015）。早期感染 ToCV 的番茄產量損失可達到 75%，甚至絕產；中后期感染 ToCV 仍會對番茄造成 10%40%的產量損失（劉永光 等，2 014）。該病毒的寄主主要有茄科（Solanaceae）和夾竹桃科（Apocynaceae） 27新優(yōu)品種栽培管理本期視點產業(yè)市場病蟲防控 研究論文中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES2018（8）：27 -31以健康番茄、茄子、辣椒和馬鈴薯葉片作為陰性對照；以實驗室 ToCV 侵染性克隆接種的感病葉片作為陽性對照。采集基地內發(fā)病番茄、茄子、辣椒和馬鈴薯植株上的煙粉虱，每種植株采集約 100 頭煙粉虱成蟲。將樣品置于液氮中速凍，-80 保存?zhèn)溆谩?.2 試驗試劑TRIzol、氯 仿、無水乙醇、ddH2O、RNase-free H2O、限制性核酸內切酶（ AseI酶）、 樹脂溶液（10 mg·mL-1）。1.3 植物總 RNA 的提取樣品總 RNA 的提取采用北京華越洋生物公司多酚多糖植物 RNA 提取試劑盒，步驟依照試劑盒說明書操作。1.4 煙粉虱總 RNA 的提取煙粉虱RNA的提取采用TRIzol 法并稍作修改。研磨棒充分研磨蟲體后加入1 mLTRIzol振蕩 15 s， 室 溫 放 置 4 min； 加 入 200L 氯 仿，漩 渦振蕩 30 s，室溫 放置 3 min；4 下 12 000r·min-1離心 15 min；移取 上清液 500 L 至新的 RNasefree離心管中，加入等體積異丙醇，輕輕顛倒混勻，-20 放置 30min；4 下 12 000r·min-1離心10 min；棄上清液，用現配的75%乙醇 洗滌沉淀，8 000r·min-1離心 3 min；重復洗 滌 1 次；棄上清液，8 000r·min-1離心 30 s，小心吸出上清液 ；室溫晾干3 min，取30 L RNase-freeH2O溶解，測定OD260/OD280值， 檢測RNA的含量和純度，-80 保存?zhèn)溆谩Ｔ囼炛?復3次。1.5 cDNA 的合成以提取的總 RNA為模板，反轉錄反應的體系步驟參照 Vazyme 生物公司 Hiscript 1stStrandcDNASynthesisKit 產品 說明書進行：在 RNase free離心管 中分別加入 1 L RNase-freeH2O，4 L Radomhexamers，3 L 總 RNA；65 加熱 5 min，迅速置于冰上驟冷，并在冰上靜置 2 min；向上一步混合液中加入 10 L 2×RT Mix，2 L Hiscript EnzymeMix；混勻 后按照 25 5min，50 15min，85 5min 合成 cDNA，-20 保存?zhèn)溆谩?.6 RT-PCR 和電泳檢測ToCV 的 檢測采用 ToCV 特異性引物 ToCV-3（表 1）進行 PCR 擴增。PCR 擴增體系為：ddH2O7L，2×Taq MasterMix（Dye Plus）10 L，ToCV-3R1L（10 mol· L-1），ToCV-3F 1L（10 mol·L-1），cDNA 模板 1 L。PCR 程序 為：95 5min；95 30s，56 30s，72 1min，35個循環(huán)；72 延伸 10 min，4 保存。PCR 產物經1% 瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并記錄結果，產物純化回收后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序分析。表 1 引物信息引物名稱 引物序列（5-3）ToCV-3 F：AAACTGCCTGCATGAAAAGTCTCR：GGTTTGGATTTTGGTACTACATTCAGTWT F：CTTGGTAACTCTTCTGTAGATGTGTGTTR：CCTTCCCGCAGAAGAAATTTTGTTC1.7 煙粉虱帶毒率的檢測從每種植株上采集的煙粉虱中隨機選取 8 頭，采用 ToCV 特異性引物 ToCV-3（表 1）進行 ToCV檢測，每種植株 3 次重復，統(tǒng)計煙粉虱的帶毒率。煙粉虱帶毒率 =攜帶 To CV 的煙粉虱數目 / 檢測煙粉虱數目 ×100%1.8 煙粉虱生物類型的鑒定煙粉虱總 DNA 的提取：取 3 L 蛋白酶 K 于封口膜上，將每只煙粉虱置于其中研磨成勻漿后移至 PCR 管中，加入 20 L 10mg·mL-1的樹脂溶液混勻，然后置于 37 孵育 1 h，96 10min。PCR 擴 增 體 系 為 20 L：2×Taq MasterMix10L，上、下 游引物 WT（表 1）各 1 L（10 mol·L-1），模板 1 L，ddH2O7L。PCR 程序：95預變性 5 min；95 15s，53 45s，72 1min，35 個循 環(huán)；72 10min，PCR 產物 取 5 L進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。酶切體系：加入 AseI0.5L，3.1×buffer 2L，ddH2O7.5L，與 10 L 擴增 產物混勻后置于 37 34 h，酶切后取 5 L 產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。從每種植株上采集的煙粉虱中隨機選取 20 頭進行檢測，試驗重復 3 次。2 結果與分析2.1 茄科蔬菜田間感染 ToCV 的癥狀與健康植株相比，田間番茄、茄子、辣椒、 28新優(yōu)品種栽培管理本期視點產業(yè)市場病蟲防控 研究論文中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES馬鈴薯病株的葉片表現出底部葉片黃化，葉脈濃綠而脈間褪綠黃化，葉片變脆且易折。感病嚴重的植株整株褪綠黃化、果實不能正常膨大，顏色偏白；葉片脈間褪綠黃化，變厚、變脆且易折（圖 1）。2.2 茄科蔬菜 ToCV 的發(fā)生率對4種茄科蔬菜上疑似感染ToCV的樣品進行 RT-PCR 檢測，擴增出條帶大小為 449bp 的特異性條帶，與目標條帶一致（圖 2）。對目標條帶純化回收測序后在 NCBI 上進行比對，結果顯示與北京番茄 ToCV 分離物（KC887999.1）部分序列相似度達到99.0，表明所擴增到的基因片段屬于ToCV的基因序列，確認此次采集的樣品被ToCV感染。檢出率結果顯示，番茄樣品的 ToCV 感染率為 100%，茄子、辣椒和馬鈴薯樣品的感染率分別為 80%、85%和 70%（圖 2）。2.3 煙粉虱體內 ToCV 的帶毒率檢測收集病葉上的煙粉虱，并進行ToCV的RT-PCR 檢測，PCR 擴增得到條帶大小為 446bp 的特異性條帶，與目標片段大小一致（圖 3）。從采集的煙粉虱中，每種植株隨機選取 8 頭進行 ToCV 帶毒率檢測（表 2），番茄上煙粉虱 ToCV 的平均感染率最高，為 87.5%，其次為茄子和馬鈴薯，辣椒上煙粉虱 ToCV 的平均感染率最低。圖 1 4 種茄科作物感染 ToCV 的癥狀A，感病番茄；B，感病辣椒；C，感病馬鈴薯；D，感病茄子；E，健康番茄；F，健康辣椒；G，健康馬鈴薯；H，健康茄子。彩色圖版見中國蔬菜網站：www.cnveg.org。圖 2 4 種茄科蔬菜 ToCV PCR 檢測結果M，DNAmarker；120，樣品；A，番茄；B，茄子；C，馬鈴薯；D，辣椒；CK，陰性對照；P，陽性對照。2.4 煙粉虱生物類型鑒定對 4 種茄科蔬菜上采集的煙粉虱進行生物種群鑒定，提取單頭煙粉虱總 DNA 并進行 PCR 擴增，A B C DE F G H圖 3 煙粉虱體內 ToCV PCR 檢測結果 M，DNAmarker；12，番茄上煙粉虱樣品；34，茄子上煙粉虱樣品；56，辣椒上煙粉虱樣品；79，馬鈴薯上煙粉虱樣品；CK，陰性對照；P，陽性對照。100bpM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 CK P5000bp3000bp2000bp1000bp750bp500bp250bpM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 CKP500bp500bp500bp500bpABCD29新優(yōu)品種栽培管理本期視點產業(yè)市場病蟲防控研究論文中國蔬菜CHINAVEGETABLES產物經 AseI 消化酶切電泳（圖 4），結果顯示該基地煙粉虱均為 MED 煙粉虱（Q 煙粉虱）。3 結論與討論本試驗采集了湖南省蔬菜研究所基地 4 種茄科蔬菜植株葉片，利用 RT-PCR 方法檢測疑似發(fā)病植株葉片感染 ToCV 的情況，經序列分析比對，確認了 ToCV 已經侵染湖南省的茄科作物，證實該病毒已經在湖南省發(fā)生。近年來，ToCV 對我國以番茄為主的蔬菜產量和品質造成了重大損失，目前針對ToCV 的研究工作主要在其分布、田間診斷和優(yōu)化檢測技術、致病機理、病蟲互作等方面展開。2004 年 Tsai 等（2004）在我國臺灣首次發(fā)現ToCV，隨后 Zhao 等（2013）報道了 ToCV 在北京的發(fā)生，劉永光等（2014）發(fā)現 ToCV 在山東暴發(fā)，目前 ToCV 已在天津（高利利 等，2015） 、河北（孫國珍 等，2015）、河 南（胡京昂 等，2015）、山西、 陜西、浙江、內蒙古（鄭慧新 等，2016）、吉林、 遼寧（王翠琳 等，2017）、廣 東（湯亞飛 等，2017）、海南（Tang etal.，2017） 、云南（劉微 等，2018）等地相繼被發(fā)現。近年來國際貿易的頻繁交流，工廠化苗木調運可能使感染 ToCV 的植株進入我國，加之煙粉虱在我國擴散流行，這些原因使得ToCV 在我國自沿海向內陸迅速蔓延。湖南省周邊省市中目前只有廣東省已經報道了 ToCV 的發(fā)生，由于湖南省蔬菜種植種類眾多，苗木調運繁雜，這些原因都使得調查 ToCV 病毒最初來源的工作巨大且復雜，因此需要進一步分離純化和鑒定分離物的病毒株系，對比確認其株系來源，從而精準地對ToCV 進行防控，同時應通過加強對煙粉虱的檢疫檢驗，減少人為因素造成煙粉虱的傳播。在我國 ToCV 主要依靠煙粉虱進行傳播。2003年首次在云南省一品紅（ Euphorbia pulcherrima）上發(fā)現 MED 煙粉虱以來（Chu etal.，2006），MED煙粉虱現已遍布全國。目前的研究顯示 ，與其他煙粉虱相比，MED 煙粉虱具有分布廣泛、擴散能力強、繁殖率高、抗藥性強且廣的特點。同時，在我國的大多數農業(yè)系統(tǒng)中，MED 煙粉虱已經快速取代 MEAM1 煙 粉 虱（Chu etal.，2010；Xi，2010；Xinetal.，2016）。已 有研究表明，MED 煙粉虱比MEAM1 煙粉虱傳播 ToCV 的能力更強（Shi etal.，2017）。因此，應正確識別煙粉虱的生物類型，從而采取正確措施對煙粉虱進行防治，以達到治蟲防病的目的。本試驗中煙粉虱 ToCV 的帶毒率較高，但由于本試驗采集的樣本數量較少，后期應擴大煙粉虱采集數量，加強對煙粉虱攜帶 ToCV 的監(jiān)測。目前 ToCV 的防治仍以預防為主，可以通過選用無病蟲害的幼苗、培育 ToCV 抗性新品種、田間設置防蟲網、懸掛粘蟲板、合理換茬，達到早預防、早控制的效果。目前 ToCV 的發(fā)生和流行情況日趨嚴重，本試驗首次報道 ToCV 在湖南省的發(fā)生，表明 ToCV 有從沿海向內陸擴散的趨勢，因此必須提高警惕防止 ToCV 的進一步蔓延，同時要加強對煙粉虱 -ToCV- 植物互作的研究，為 ToCV 的防治和治理奠定理論基礎。參考文獻高利利，孫國珍，王勇，高葦，張春祥，張安勝，竺曉平2015天津地區(qū)番茄褪綠病毒的分子檢測和鑒定華北農學報，30（3）：211-215胡京昂，萬秀娟，李自娟，黃文，李武高，應芳卿2015河南番茄褪綠病毒的分子鑒定中國蔬菜，（12）：25-28劉微，史曉斌，唐鑫，張宇，張德詠，周序國，劉勇2018云南番茄褪綠病毒和番茄黃化曲葉病毒復合侵染的分子鑒定 園藝學報，45（3）：552-560劉永 光，魏家鵬，喬寧，李美芹，劉曉明，竺曉平2014番茄褪綠病毒在山東暴發(fā)及其防治措施中國蔬菜，（5）：67-69孫國珍，高利利，陸文利，王勇，張安勝，竺曉平2015河北省設施番茄褪綠病毒分子檢測和鑒定研究北方園藝，（9）：95-98圖 4 煙粉虱生物類型鑒定結果M，DNA marker；120，單頭煙粉虱樣品。表 2 4 種茄科蔬菜上煙粉虱帶毒率統(tǒng)計宿主植物 平均帶毒煙粉虱數目 平均感染率/%番茄 7.0 87.5茄子 6.7 83.3辣椒 5.3 66.7馬鈴薯 6.7 83.3M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 205000bp3000bp2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp 30新優(yōu)品種栽培管理本期視點產業(yè)市場病蟲防控 研究論文中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES湯亞飛，何自福，佘小漫，藍國兵2017侵染廣東番茄的番茄褪綠病毒分子鑒定 植物保護，43（2）：133-137王翠琳 ，馮佳，孫曉輝，王少立，趙靜，劉金亮，竺曉平2017北方四省區(qū)番茄褪綠病毒的分子鑒定 植物保護，4 3（2）：141-145趙黎明2015番茄褪綠病毒的分子鑒定、全基因組序列分析及檢測技術的建立碩士論文泰安：山東農業(yè)大學鄭慧新，夏吉星，周小毛，張友軍2016警惕煙粉虱傳播的番茄褪綠病毒病在我國快速擴散 中國蔬菜，（4） ：22-26周濤，楊普云，趙汝娜，師迎春，原鍇，范在豐2014警惕番茄褪綠病毒在我國的傳播和危害植物保護，（5）：196-199ChuD，Zhang YJ，Brown JK，Cong B，Xu BY，Wu QJ，Zhu GR2006The introductionoftheexoticQbiotypeofBemisia tabacifromtheMediterraneanregionintoChinaonornamentalcropsFloridaEntomologist，89（2）：168-174ChuD，Wan FH，Zhang YJ，Brown JK2010Change inthebiotypecompositionofBemisia tabaciinShandongprovinceofChinafrom2005to2008Envi ronmentalEntomology，39（3）：1028-1036Landeo-Ríos YM，Nav as-CastilloJ，Mori onesE，Ca nullizaresMC2015Genetic diversityandsilencingsuppressionactivityofthep22proteinofTomato chlorosis virus，is olatesfromtomatoandsweetpepperVirus Genes，51（2）：283-289OrfanidouC，Pappi PG，Efthimiou KE，Katis N，Maliogka VI2016Transmission ofTomato chlorosis virus（ToCV）by Bemisia tabacibiotypeQandevaluationoffourweedspeciesasviralsources PlantDisease，100（10）：10.1094/PDIS-01-16-0054-REShiX，Tang X，Zhang X，Zhang DY，Li F，Yan F，Zhang YJ，ZhouXG，Liu Y2017Transmission efficiency，preference andbehaviorofBemisia tabaciMEAM1andMEDundertheinfluenceofTomato chlorosis virusFrontiers inPlantScience，8：2271-2280TangX，Shi X，Zhang D，Li F，Yan F，Zhang Y，Liu Y，Zhou X2017Detection andepidemicdynamicofToCVandCCYVwithBemisia tabaciandweedinHainanofChinaVirology Journal，14：doi：10.1186/s12985-017-0833-2TsaiWS，Shih SL，Green SK，Hanson P2004First reportoftheoccurrenceofTomato chlorosis virusandTomato infectious chlorosis virusinTaiwanPlant Disease，88（3）：311WintermantelWM，Wisler GC2006Vector specificity，host range，and geneticdiversityofTomato chlorosis virusPl antDisease，90（6）：814-819WislerGC，Li RH，Liu HY，Lowry DS，Duffus JE1998 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theinvestigationforvegetablediseasesofHunanProvinceinJuly2016，symptoms of interveinchlorosisandleafyellowingwerediscoveredonSolanaceaevegetableleaves，including tomato，pepper，eggplantandpotatoplants.ThesymptomsweresuspectedasTomato chlorosis virus（ToCV）and alargenumberofBemisia tabaciwerefoundonthebackofleaves.Theinfectedleavesoftomato，pepper，eggplant andpotatoandBemisia tabacisamplesweredetectedbyRT-PCRusinggenespecificprimersofToCVheatshockprotein70（HSP70）sequence，and anexpectedfragmentwereobtained.Theresultsofsequenceanalysisrevealedthatthefragmentsharedthehighestnucleotideidentityat99.0%withtheisolatesfromBeijing（KC887999.1）. TheinfectionrateofToCVofthese4kindsofSolanaceaevegetableswas70%-100%.ViruliferousrateofBemisia tabaciwas66.7%-87.5%.ThewhiteflybiotypewasMED.ThisisthefirsttimethatHunanProvinceconfirmstheexistingofToCV，which needsspecialattentionandstrongerprevention.Key words： Tomato chlorosis virus；Solanaceae vegetablecrops； Bemisia tabaciPanH，Chu D，Ge D，Wang S，Wu Q，Xie W，Jiao X，Liu B，Yang X，Yang N，Su Q，Xu B，Zhang Y2011Further spreadofanddominationbyBemisia tabaci（ Hemiptera： Aleyrodidae）biotype QonfieldcropsinChinaJournal ofEconomicEntomology，104 （3）：978-985Garcíacano E，Navascastillo J，Moriones E，Fernándezmu ñ ozR2010 ResistancetoTomato chlorosis virusinwildtomatospeciesthatimpairvirusaccumulationanddiseasesymptomexpressionPlantDisease，100（6）：582-592 31新優(yōu)品種栽培管理本期視點產業(yè)市場病蟲防控 研究論文中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES