東方百合‘演員’DXS基因的克隆與表達分析_張浩宇.pdf

<p>西北 植 物學(xué)報 ，（）： 文章編 號 ：（） &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; ：收稿 日 期 ：；修改稿收到日期 ：基金 項 目 ：山西省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目 （）；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)引進人才科研啟動項目 （）；山西省研究生教育改 革研究課題 （）作者簡 介 ：張浩宇 （），女 ，在讀碩士研究生 ，主要從事百合花香研究 。：通信作 者 ：杜方 ，博士 ，教授 ，主要從事花卉種質(zhì)資源創(chuàng)新與育種研究 。：東方 百 合演員基因的克隆與表達分析張浩 宇 ，樊 俊苗 ，王婷 ，杜方（山西 農(nóng) 業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院 ，山西太谷）摘要 ：以東 方 百合 演員 花瓣為試驗材料 ，采用 技術(shù) ，克隆 得到百合 脫氧 木 酮糖磷酸合成酶基因的 全長，命名 為（登錄號 為 ）。序列分 析表明 ，基 因 序列全長 ，其中開放閱讀框包含 ，編碼個氨基 酸，相對分子量大小約為，等電點 為，化學(xué)式為 。系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示 ，與獼猴桃和萬壽菊 聚為一 類，屬于型 ，是功能較保守的一類 。實 時熒光定量 結(jié) 果分 析表明 ，基因在不同品種百合花瓣中均有表達 ，且濃 香 型百合 基因表達量比淡香型和無香型百合高 。該研究結(jié)果為百合 生物學(xué)功能研究奠定了基礎(chǔ) ，同時 也 為百合花香育種提供了理論依據(jù) 。關(guān)鍵詞 ：百合 ；脫氧木 酮糖磷酸合 成酶 ；表 達特 征中圖分類號 ：； 文獻標(biāo) 志碼 ： ， ， ， （ ， ， ，）： （） ， （ ） ， ， ， ， ， ：； （）； 萜類物 質(zhì)廣泛存在于自然界生物體內(nèi) ，大約有 種 ，構(gòu)成了 最大的天然產(chǎn)物家族。在高等植 物中 ，有些萜類物質(zhì)參與生理代謝活動 ，如光合作用 、呼吸作用和細胞周期控制等，有些萜 類化合物如丹參中的丹參酮類具有藥理活性，有些萜 類化合物為食品工業(yè)和化妝品工業(yè)的重要原料，同時低分子 量的萜類也是百合花香成分中的重要物質(zhì)。萜類物 質(zhì)合成途徑有位于質(zhì)體的甲基赤 藻 糖 醇磷 酸 （ ，）和位于 胞質(zhì)的甲羥戊酸 （，）兩條途 徑。脫氧木 酮糖磷酸合成 酶 （ ，）是途徑中 的關(guān)鍵酶，并且已 有研究表明其在擬南芥中發(fā)揮著限速酶作用，是萜類 次生代謝物質(zhì)等下游產(chǎn)物的一個關(guān)鍵調(diào)控位點 。百合作為主要的切花和盆花材料 ，在國內(nèi)外花卉市場占有重要地位。百合不 僅具有艷麗的色彩 ，還有豐富的香型 ，有墨香 、濃香 、甜香 、淡香以及無香。近年來 ，百合花香是學(xué)者研 究的一大熱點 。從揭 示 花 香 成 分、釋 放 器 官、散 發(fā) 規(guī)律到代謝 通路的挖掘以及相 關(guān)基因 、調(diào)控基因的克隆和原核 生物表達驗證，都取得 了突破性的進展 。通常亞洲百合無香味 ，而東方百合香味濃烈 ，嚴(yán)重影響消費者的購買欲 。因此 ，改良花香是育種家孜孜以求的育種目標(biāo) 。已有研究表明 ，與有香百合相比 ，無香百合中單萜類化合物的釋放量很低或根本檢測不到。因此 ，研究 百合單萜類花香物質(zhì)的代謝通路及其關(guān)鍵基因?qū)τ诮沂净ㄏ悴町惐举|(zhì)原因具有重要意義 。本研究采用技術(shù)從東 方百合 演員 （ ）花瓣中 克隆得到的全長 ，并對其 在不同香型百合品種間表達特征進行了研究 ，為今后通過基因工程改良百合花香提供了理論依據(jù) 。 材料 和 方法 材料試 驗材 料 （表）種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院園藝站百合圃 。年月陸續(xù) 取不同品種百合盛開期花瓣 ，經(jīng)液氮速凍 ，保存 ，備用 。 方法 提取與第一鏈 合成使 用公 司 裂 解 液 ，采 用法 提 取 百 合 總。使 用生 物光度計檢測的 濃度 和純度 ，用瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量 ，按照試劑盒 說明反轉(zhuǎn)錄成。 基因的 克隆從核酸數(shù) 據(jù)庫中查詢獲得條百合序列信 息 ，登錄號為。分別設(shè) 計和引物 （表），以 演員 為模板 ，利 用表 引物 序 列 引 物 名 稱 引物序 列 （） &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;表 試驗用材料基本信息 編號 品種名 雜種系 香型 特 里昂 菲特 麝東百 合 甜香 完美 喇叭百 合 墨香 演員 東方百 合 濃香 八 點后 東方百 合 濃香 白夢 東方百 合 濃香 羅賓娜 東喇百 合 濃香 黃 色風(fēng) 暴 東喇百 合 濃香 金石 麝亞百 合 淡香 布林迪 西 麝亞百 合 淡香 佩 維亞 麝亞百 合 淡香 朱麗葉 新鐵炮 百合 淡香 羅馬廣 場 亞洲百 合 無香 小 珍珠 亞洲百 合 無香 西北植物學(xué)報卷公司試劑盒 進行擴 增 。反應(yīng)總 體系為，其中 ，×引物，（）引物， ，× ， 。擴增條 件為 ：，個循環(huán) ；，個循環(huán) ，個循環(huán) 。瓊脂糖凝膠電泳檢測 ，切膠回收目的片段 ，加反應(yīng)按照天根加試劑的方法標(biāo)準(zhǔn)操作 。加后 ，連接 載 體（），轉(zhuǎn) 化 感 受態(tài) 細胞 （全式金 ），菌液驗 證后送 生工生物工程 （上海 ）股份有限公司測序 。利用軟件拼 接測序結(jié)果 ，得到編碼序列 。 生物信 息學(xué)分析利用（：）預(yù) 測分子 量 和 理 論 等 電 點。用在 線 軟 件（：）預(yù)測蛋白結(jié) 構(gòu)域。通過（：）在線軟 件進行信號肽預(yù)測。用在線 軟件（：）分 析 蛋 白 質(zhì) 親 水 性 疏 水性 ；用 （：）在線軟 件對進 行 跨 膜 性 分 析。用（： ）預(yù)測蛋 白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。用 軟件進 行序列比對及翻譯 ，用軟件構(gòu) 建系統(tǒng)進化樹。 實時熒 光定量分 析根據(jù) 已克隆的百合的序列分 析結(jié)果 ，設(shè)計熒光定量引物 ，比對確 定引物特異性 。分別以不同品種盛開期花瓣的為模板 ，以基因作 為內(nèi)參基因 ，反應(yīng)引物、見表。參照 杜方等的步驟 進行熒光定量，研 究不 同品種百合基因表 達差異 ，每個試驗進行次重復(fù) 。所得數(shù)據(jù)采用進行平 均數(shù)統(tǒng)計 ，法計算相 對表達量 ，以 軟件進行 方差分析 ，多 重比 較 ，利用 繪圖 。 結(jié) 果 與 分析 基因全 長的克隆通 過法 ，以東方 百合 演員 花瓣為模板 ，分 別進行和擴增 、克隆和測 序分析 ，獲得末端序列長度 ，獲得末端序列 長度 （圖），與預(yù)期 結(jié)果一致 。命名該基因為，登錄號 為。該基因 全長 ，其中包 含 ， 和開放 閱讀框 ，編碼個氨基酸 。通 過軟件翻 譯獲得基因編碼的氨基酸序列 （圖）。 蛋白結(jié) 構(gòu)分析預(yù)測氨 基酸序列中含有個功能結(jié)構(gòu)域 ，分別是端合 成結(jié) 構(gòu)域 、結(jié) 合結(jié) 構(gòu)域和轉(zhuǎn)酮醇酶結(jié)構(gòu)域 （圖）。分析該 蛋白相對分子量為，理論等 電點為，化學(xué)式為，原子量。信號肽 結(jié)果分 析 表 明 ，不 屬 于 分 泌 蛋 白 。（ ）值為負值 ，表 明蛋白屬于親水性蛋白 。蛋白跨膜性分析顯示無跨膜區(qū)域 ，不屬于膜蛋白 。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示 ，其氨基酸組成螺旋 （）為個 （），延伸鏈 （）為個 （），轉(zhuǎn)角 （）為個（），無規(guī)則 卷曲為個 （）。 多序列比對與聚類分 析百合 演員 中克隆的基因分 別與已分離獲得的基因、序列一 致性都高達（圖），與無油 樟 （ ）、蔓花生 （ ）、黃芪 （ ）的 一 致 性 分 別 達、。用軟件對種可以產(chǎn)生萜類化合物的植物進行聚 類分 析 ，結(jié)果表明所獲得的百合基因?qū)儆诘谝活惢?，是 較為保守的管家基因 （圖）。 百 合基因在品種間的表達 模式采用方 法檢 測在個百合品 種的表達情況 。由圖可知 ，在不同 品種中均有表達 ，在濃香型東方百合 白夢 中表達量最高 ，在無香的亞洲百合 小珍珠 中最低 ；濃香型百合圖 基因 片 段 電泳圖 期張浩宇 ，等 ：東 方百合 演員 基因的克隆與表達分析為 起始 密碼子；為 終止 密碼子；粉色 、藍色和綠色箭頭分別表示 端 合 成結(jié) 構(gòu)域 （）、結(jié)合結(jié)構(gòu) 域 （）和轉(zhuǎn)酮醇酶結(jié)構(gòu)域 （）在氨基酸序列中的起止位置圖 百 合 基因的核酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列 ； ； ， ， ， （） （） 表達量 與淡香型和無香型之間差異顯著 ，但淡香型和無香型百合基因表達差異不顯著 ；同一香型百合之間基因表達差異也不盡相同 ，濃香型百合之間存在顯著差異 。在百合不同品種間的 表達量表明 ，不同品種百合花香的差異與基因表達 有關(guān) 。 討論萜類物 質(zhì)在植物生長調(diào)節(jié) 、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和自身防御等方面發(fā)揮重要作用。張輝秀 等研究表 明濃香型百合萜烯類釋放量最高 ，在淡香類中沒有檢測到 ，并且認為其中兩種單萜成分是百合花致香的關(guān)鍵成分 ?；蚴?萜類物質(zhì)合成途 徑的第 一個關(guān)鍵酶基因 ，萜類含量與的表達 水平密切相關(guān)，目前已 在種植物中分離和克隆。基因過 表達或干擾表達均能夠改變次生代 謝 物 質(zhì) 合 成 ，在 擬 南 芥 （ ）、胡 蘿 卜 （ ）、寬 葉 薰 衣 草（ ）和 獼 猴 桃 （）等植物 中都已進行了初步功能驗證 。不同物種基因家 族成員數(shù)不同 ，以前的研究認為酶 由個基 因編碼 ，基于測序的研 究表明 ，胡蘿卜和煙草 （ ）有中分 別有個和個 ，對于百合基因研究 甚少 ，目前 ，已知的百合家族成 員至少有個 ，前人只在 中獲得 部分序列，張騰旬 在東方百合 西伯利亞 品種中也克隆得 到個基 因全 長 ，屬 于型，但序列 信息尚未公布 。本研究通過技術(shù) ，克隆 了百合基因全長 ，并利 用生物信息學(xué)手段分析研究其編碼的蛋白特性 ，該蛋白具有親水性特點 ，不屬于分泌蛋白 ，由此推測它只在質(zhì)體中發(fā)揮功能 。通過對基因的表達規(guī)律研究 ，發(fā)現(xiàn)其表達量與器官 、花 、果實發(fā)育程度 、晝夜節(jié)律 、品種等有關(guān) 。研究表明在夜香 樹 （ ）葉片中 的表達量總體高于花器官。隨著花 朵開放級數(shù)和果實成熟 ，玫瑰花瓣和獼猴 桃果實中基因表達量逐級增加 。茉莉花 瓣中基因的 表達具有晝夜節(jié)律性。課題組 之前的研究表明 ，在百合 索 邦 花和鱗片中顯著高表達 ，但只在 朱麗葉 花中顯著高表達。本研究發(fā) 現(xiàn) ，基因的表達水平與花香的 釋放呈現(xiàn)一定的規(guī)律 ，濃香型百合基因表達量顯著高于淡香型西北植物學(xué)報卷紅 色 部 分為 個序列不完全一致位點 ；黑色方框中 為 起始 密碼子 ，方框中 為 終止 密碼子圖 百合 基因多序列比對 ； ， 圖 與其他 植物 蛋白的系統(tǒng)進化樹 和無香 型百合 。的研究 結(jié)果表明 ，濃香型百合 比淡香 型 基因表達 量高，與本研 究結(jié)果一致 。本試驗主要從百合中分離獲得一個基因品種 名 稱同表 ；不同小寫字母代表不同品種的差異顯著性 （）圖 在不同品種百合的相對表達量 ； （） 期張浩宇 ，等 ：東 方百合 演員 基因的克隆與表達分析全長 ，對其 進行了初步研究 ，發(fā)現(xiàn)屬于，是 功能 較為保守的一類 ，分析了該基因在不同品種中的表達模式 ，推測在百合 花香萜類化合物合成途徑中起重要作用 ，后期需進一步對百合基因家 族成員數(shù)目 、分類和功能以及在百合花香代謝調(diào)控中的作用機制進行研究 ，對于明確花香差異的本質(zhì)原因 ，以及利用現(xiàn)代生物育種技術(shù)改良百合花香具有一定的意義 。參考文獻 ： ， ， ， ： ，（）：趙恒偉 ，葛鋒 ，孫穎 ，等 植物萜類物質(zhì) 生物合成的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及其應(yīng)用前景 中草藥 ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ， ，（）： 馬 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) ，龐 瀟卿 ，諶容 ，等 萜類化合物生物合成途徑中關(guān)鍵酶的研究進展 杭州師范大學(xué)學(xué)報 （自然科學(xué)版 ），（）： ， ， ， （ ），（）：唐彪 ，胡增輝 ，冷 平生 ，等 濃香型和淡香型百合單萜合酶基因差異表達 北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報 ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ， ， ，（）： ， ， ， ， ， ，： ， ，： ， ， ， ，（）： 陳莉 ，辛海波 ，李 曉艷 ，等 百合 基因的克隆與表達分析 林 業(yè)科學(xué) ，（）： ， ， ， ，（）：杜方 百合引種栽培及分 子研究 北京 ：中國林業(yè)出版社 ，：范燕萍 ，范 麗琨 不同類型百合花瓣揮發(fā)性香氣成分分析中 國園 藝學(xué)會觀賞園藝專業(yè)委員會年學(xué)術(shù) 年會 張輝秀 ，胡 增輝 ，冷平生 ，等 不同品種百合花揮發(fā)性成分定性與定量分析 中國農(nóng)業(yè)科學(xué) ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ， ： ，： ， ， ， ，（）：張 輝秀 ，冷 平生 ，胡增輝 ，等 西伯利亞 百合花香隨開花進程變化及日變化規(guī)律 園藝學(xué)報 ，（）： ， ， ， ，（）：孔瀅 ，孫明 ，潘會堂 ，等 花香代謝與調(diào)控研究進展 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報 ，（）： ， ， ， ，（）：李 路路 ，王歡 ，孫明 ，等 岷江百合單萜合酶基因克 隆與表達分析 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報 （自然科學(xué)版 ），（）： ， ， ， （ ），（）：王歡 百合苯甲酸甲酯代謝相關(guān) 基因 的 克隆與分析 北京 ：北京林業(yè)大學(xué) ，李紹翠 ，姜 新強 ，丁愛琴 ，等 月季 基因的 克隆及表西北植物學(xué)報卷達特 征 分析 華北農(nóng)學(xué)報 ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ： ， ，（ ）： ， ， ， ： ，（）：徐麗 ，陳新 ，宗曉娟 ，等 甜 櫻桃砧木 基 因 的 克隆與分析 核農(nóng)學(xué)報 ，（）： ， ， ， ，（）：董慧霞 ，理 永霞 ，賈秀貞 ，等 楊樹 基因的克隆與分析西北 農(nóng) 林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版 ），（）：， ， ， ， （ ），（）：，趙佳 ，劉榮 ，等 月季花青素苷相關(guān) 蛋 白基 因的克隆和表達分析 中國農(nóng)業(yè)科學(xué) ，（）： ， ， ，（）： 杜方 ，樊 俊苗 ，王婷 ，等 百合品種和器官中花香和抗性基因 的表達模式 分子植物育種 ，（）： ， ， ， </p>