大白菜抗根腫病的抗源篩選和分子標(biāo)記鑒定_朱明釗

<p>大白菜抗根腫病的抗源篩選和分子標(biāo)記鑒定朱明釗 張淑江 張 慧 章時蕃 李 菲 王曉武 武 劍 李國亮 &nbsp;魏云曉 岳麗昕 孫日飛*（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京100081）摘 要：以 3 種根腫菌 M01、M02、M03 為病原菌菌源，對 24 份大白菜材料進(jìn)行接種鑒定和分子標(biāo)記鑒定，旨在獲得優(yōu)良的抗源材料并明確材料中含有的抗病基因。結(jié)果表明：24 份大白菜材料中共有 10 份抗病材料，5 份材料對 3 種根腫菌都表現(xiàn)抗病：其中CR004和CR007含有根腫病抗病基因 CRk，CR013 含有抗病基因 CRa、 CRbkato、 CRk 和 Crr3，CR015 和CR016 含有抗病基因 CRa、 CRbkato和 Crr3；3 份材料對根腫菌 M01 和 M02 表現(xiàn)抗?。篊R012 含有抗病基因 CRa 和 CRbkato，CR014 和 CR018 含有抗病基因 CRa、 CRbkato和 CRk；抗根腫菌 M01 的材料 CR021 含有抗病基因 Crr2 和 CRk；抗根腫菌 M02的材料 CR023 含有抗病基因 CRc 和 CRk。關(guān)鍵詞：大白菜；根腫病；抗源篩選；分子標(biāo)記Katoetal.，2013；Chu etal.，2014）， Crr4 位于 A06連鎖群（Suwabe etal.，2006）， Crr1 位于 A08 連鎖群（Suwabe etal.，2003）； 另 外，Gao 等（2014）將 1 個抗病基因定位到了與 CRa 相同的位置（Uenoetal.，2012），該基因可能與 CRa 是同一基因；王彤彤等（2012）將 1 個抗病基因定位到了 A08 連鎖群并證明了該基因與 Crr1 不在同一區(qū)域，是一個新的抗病基因。以往的基因定位工作只能定位1個或2個抗病基因，而對根腫菌分化的眾多的生理小種，單個基因往往不起作用，因此，將多個抗病基因聚合到同一份材料當(dāng)中是提高材料抗病的廣泛性和耐久性的 有 效 方 法（Matsumoto etal.，2012；Hatakeyamaetal.，2017）。本試驗以根腫菌 M01、M02 和 M03為病原菌菌源，對 24 份大白菜材料進(jìn)行接種鑒定和分子標(biāo)記鑒定，旨在篩選出抗多個根腫菌的抗源，并明確與之相關(guān)的抗病基因，以期為今后抗根腫病聚合育種工作奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 試驗材料供試24份大白菜材料（表1）保存于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所白菜課題組，以感病大白菜作為對照。供試根腫菌M01、M02和M03分別朱明釗，男，碩士研究生，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：18206381396163.com* 通訊作者（Correspondingauthor）：孫日飛，男，研究員，博士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：sunrifeicaas.cn收稿日期：2017-08-21；接受日期：2017-11-09基金項目 ：國家重點研發(fā)計劃項目（2017YFD0101802），農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室項目大白菜根腫病是由蕓薹屬根腫菌（ Plasmodio-phora brassicaeWoron.）侵染引起的專性寄生的世界性土傳病害，主要危害十字花科作物，最早發(fā)現(xiàn)于地中海西岸和歐洲南部，現(xiàn)在許多國家都有發(fā)生（楊永林，1990）。根腫菌的休眠孢子可以在土壤中存活 7 a 以上（Karling，1968），因此，田間一旦受到污染，將長期不再適合十字花科作物的種植。通過田間管理和生物化學(xué)防治的方法不能從根本上防治根腫病，選育抗根腫病的大白菜新品種是最經(jīng)濟有效的方法（Kuginukietal.，1999）。迄今為止，在大白菜中至少有 12 個抗根腫病基因被定位出來，其中 Crr2位于A01連鎖群（Suwabeetal.，2003）， CRc 位 于 A02 連 鎖 群（Sakamotoetal.，2008）， CRa、 CRb、 CRbkato、 CRk、 Crr3、PbBa3.1、 PbBa3.3 和 Rcr1 都位于 A03 連鎖群（Hiraietal.，2004；Piao etal.，2004；Sakamoto etal.，2008；Matsumoto etal.，2012；Chen etal.，2013；40新優(yōu)品種栽培管理本期視點產(chǎn)業(yè)市場病蟲防控 研究論文中 國 蔬 菜 &nbsp; &nbsp; CHINA VEGETABLES 2018（3）：40-45采自遼寧沈陽、云南昆明和河南鄭州，根腫病菌根置于 -20冰箱中保存?zhèn)溆谩?.2 接種方法1.2.1 菌液的制備 2017 年 3 月 8 日在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所實驗樓 406 進(jìn)行，制備方法在Kawamura 等（2017）的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，取 20g 保存于 -20 冰箱的根腫病菌根，室溫下解凍后加入200 mL蒸餾水于攪拌器中攪碎，8層紗布過濾，濾液于 4、4 000r·min-1離心 10 min，棄上清液，用無菌水懸浮沉淀，用血球計數(shù)板將濃度調(diào)至 2×107個·mL-1，4冰箱保存?zhèn)溆谩?.2.2 接種 2017年3月在本所南圃場春化室進(jìn)行，采用浸根法（柴阿麗 等，2015）接種。3 月 2日在鋪有單層濾紙的培養(yǎng)皿中對大白菜種子進(jìn)行催芽，6 d 后將根系浸入配制好的根腫菌懸浮液中，30min 后將幼苗栽入提前裝好基質(zhì)并灌透底水的 50孔穴盤中，每穴 1 株，每處理 6 穴，3 次重復(fù)。42 d 后進(jìn)行病情調(diào)查。1.3 病情調(diào)查病 情 分 級 標(biāo) 準(zhǔn) 參 考 Kuginuki 等（1999）、Suwabe 等（2006）、Kato 等（2013）的方法：0 級，根部無腫大現(xiàn)象；1 級，側(cè)根根部有少量小腫瘤；2 級，側(cè)根根部有較大腫瘤或主根上有小腫瘤；3級，主根和側(cè)根都出現(xiàn)嚴(yán)重的腫大（圖 1）。病情指數(shù)計算及抗性評價標(biāo)準(zhǔn)參考Zhang等（2015）的方法：抗病（R），病情指數(shù) 26；感?。⊿），病情指數(shù) 26。病情指數(shù) =（各病級株數(shù) × 相應(yīng)級數(shù)）/（調(diào)查總株數(shù) ×3）×100圖 1 根腫病病情分級標(biāo)準(zhǔn)0 級 1 級 2 級 3 級1.4 數(shù)據(jù)分析采用 SPSS 軟件對調(diào)查結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析： 針對每 1 份材料對 3 種根腫菌的抗性表現(xiàn)進(jìn)行方差分析； 分別計算出 24 份材料對 3 種根腫菌病情指數(shù)的平均值，然后進(jìn)行方差分析。1.5 分子鑒定1.5.1 DNA 的提取 采集 24 份大白菜材料的幼嫩葉片，采用改良 CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法（Murray&amp;Thompson，1980）提取單株 DNA，用Nanodrop2000 分光光度計測定 DNA 濃度。1.5.2 分子標(biāo)記檢測 &nbsp;對 24 份大白菜材料進(jìn)行分子標(biāo)記鑒定，共用到 22 個標(biāo)記，涉及 10 個基因。其中，標(biāo)記 HC352b-SCAR、SC2930-T-FW/-RV、SC2930-Q-FW/-RV、 CRaim-T 與 基 因 CRa 連鎖（Hayashida etal.，2008；Matsumoto etal.，2012；Uenoetal.，2012），標(biāo)記 TCR05、TCR09、TCR79、TCR108、K-3 與 基 因 CRb 連 鎖（Piao etal.，2004；Zhang etal.，2014；Chen etal.，2016）， 標(biāo)記 KBrH129J18R 與基因 CRbkato連鎖（Kato etal.，2013）， 標(biāo) 記 B50-C9-FW/-RV、B50-6R-FW/-RV與基因 CRc 連 鎖（Matsumoto etal.，2012）， 標(biāo)記 HC688-4-FW/-6-RV、HC688-4-FW/-7-RV 與基因 CRk 連 鎖（Matsumoto etal.，2012）， 標(biāo) 記BRMS-088 和 BRMS-096 分別與基因 Crr1 和 Crr2表 1 材料名稱及來源編號 名稱 來源CR001 德高 60-201-201 中國CR002 234-201-201 中國CR003 2K04-3C58-1-1-3-2-2-2-1-1-1-2 中國CR004 孢紅心 24-11C2-202-10-1-2-2-1-1-205-201 中國CR005 博特 6 號 C35-4-1-2-5-1-2-4-203 中國CR006 BP058-8-6-2- -4-201-4-1 -4-3-1-2 中國CR007 CCR12094 抗大 3 號母本保持系 -1-1 中國CR008 XY4A-201-201-8-202-202-201-1-2-1-4-1-1-2-4-2-2-3中國CR009 CR 金錦 -201-1-3-2 中國CR010 包尖陳府 11-201-1-1-201-1 中國CR011 CR 春喜 -2-1-1-2 中國CR012 CR 金錦 -1-202-2-1 韓國CR013 CR- 利民 -201-201 韓國CR014 CR- 利民 -201-202 韓國CR015 CR- 利民 -202-2 韓國CR016 CR- 利民 -202-201 韓國CR017 CR- 涼春 -201 韓國CR018 CR- 中聯(lián)金寶 -202-201 韓國CR019 金峰 -2-1-201-4-3-3 韓國CR020 紅孩兒 -4-1C5-3-1-1-3 韓國CR021 金峰 -2-1-201-4-3×BP058 日本CR022 金娃娃 -202-3-1×ECD04-3-202 中國CR023 ECD04-1× 金娃娃 -202-3-1-201 中國CR024 CMS× 孢紅心 24-11C2（新 ）（2） 中國CK 春白菜 2（西由 08）C5-1-1-3 中國41新優(yōu)品種栽培管理本期視點產(chǎn)業(yè)市場病蟲防控 研究論文中 國 蔬 菜 &nbsp; &nbsp; CHINA VEGETABLES連鎖（Suwabe etal.，2003），標(biāo)記 OPC11-2S 與基因 Crr3 連鎖（Saito etal.，2006），標(biāo)記 M8、M9、M10 與基因 CR-A3 連鎖（Gao etal.，2014），標(biāo)記BrID11683、BrID90269 與 1 個尚未定位的基因連鎖（王彤彤 等，2012）。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 擴增體系為 10 L：PCR mix5L，1.0 mol·L-1上下游引物各0.2L，50 ng·L-1模 板 DNA 2L，ddH2O補齊至 10 L。PCR 擴增片段長度 600 bp 的標(biāo)記利用 1.5% 的瓊脂糖凝膠電泳分離，PCR 擴增片段長度 600 bp 的標(biāo)記利用 8% 的聚丙烯酰胺凝膠電泳 分離。2 結(jié)果與分析2.1 接種鑒定從圖 2 可以看出，感病對照 CK 對 3 種根腫菌都表現(xiàn)感病，說明本試驗采用的接種方法準(zhǔn)確可靠。24 份大白菜材料中，有 10 份抗病材料，14 份感病材料。其中，材料 CR004、CR007、CR013、CR015和CR016對3種根腫菌都表現(xiàn)抗病，材料CR012、CR014 和 CR018 對根腫菌 M01 和 M02 表現(xiàn)抗病，材料 CR021 只對根腫菌 M01 表現(xiàn)抗病，材料CR023只對根腫菌M02表現(xiàn)抗病。3個根腫病小種對 24 份大白菜材料平均病情指數(shù)的單因素方差分析結(jié)果表明：根腫菌M01和M02在24份材料中的致病力差異不顯著，根腫菌 M03 在 24 份材料中的致病力與 M01 和 M02 差異顯著，從材料CR014、CR017 和 CR018 的表現(xiàn)也可以看出，根腫菌 M01 和 M02 之間的致病力差異不顯著，而根腫菌 M03 的致病力與 M01、M02 差異顯著。2.2 分子標(biāo)記鑒定鑒定結(jié)果表明，本試驗用到的 22 個分子標(biāo)記中只有 10 個具有多態(tài)性，分別是 SC2930-T-FW/-表 2 不同大白菜材料的根腫病抗性及對應(yīng)的抗性基因材料 抗性 基因 材料 抗性 基因 材料 抗性 基因CR001 感病 CRk/Crr1 CR010 感病 CR019 感病 Crr2CR002 感病 CRk/Crr2 CR011 感病 Crr2 CR020 感病 CRkCR003 感病 CRk CR012 抗 M01、M02 CRa/CRbkatoCR021 抗 M01 Crr2/CRkCR004 抗 M01、M02、M03 CRk CR013 抗 M01、M02、M03 CRa/CRbkato/CRk/Crr3 CR022 感病 CRkCR005 感病 CRk CR014 抗 M01、M02 CRa/CRbkato/CRk CR023 抗 M02 CRc/CRkCR006 感病 CRk CR015 抗 M01、M02、M03 CRa/CRbkato/Crr3 CR024 感病 CR007 抗 M01、M02、M03 CRk CR016 抗 M01、M02、M03 CRa/CRbkato/Crr3 CK 感病 CR008 感病 CRk CR017 感病 CRkCR009 感病 Crr2 CR018 抗 M01、M02 CRa/CRbkato/CRkRV、SC2930-Q-FW/-RV、KBrH129J18R、B50-C9-FW/-RV、B50-6R-FW/-RV、HC688-4-FW/-6-RV、HC688-4-FW/-7-RV、BRMS-088、BRMS-096和 OPC11-2S，共涉及 7 個基因，分別是 CRa、CRbkato、 CRc、 CRk、 Crr1、 Crr2 和 Crr3。由表2可以看出，感病材料中有的不含抗病基因，有的含有抗病基因 CRk、 Crr1 或 Crr2。材料 CR012、CR014 和 CR018 對根腫菌 M01 和 M02表現(xiàn)出抗性，其中CR012含有基因抗病基因 CRa圖 2 不同大白菜材料對 3 種根腫菌的抗性鑒定結(jié)果圖柱上不同小寫字母表示不同生理小種對同一材料的致病力差異顯著（ P 0.05）。. . .*ññ3BBBBBBBBBBBBBBBCBCBCBBBBBCCCCCCCCCCDDBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBCBCC CCCCCCCCCCCCDDCR001 CR005 CR009 CR013 CR017 CR021CR003 CR007 CR011 CR015 CR019 CR023 CKCR002 CR006 CR010 CR014 CR018 CR022CR004 CR008 CR012 CR016 CR020 CR024病情指數(shù)42新優(yōu)品種栽培管理本期視點產(chǎn)業(yè)市場病蟲防控 研究論文中 國 蔬 菜 &nbsp; &nbsp; CHINA VEGETABLES和 CRbkato，CR014 和 CR018 含有抗病基因 CRa、CRbkato和 CRk； 材 料 CR004、CR007、CR013、CR015 和 CR016 對 根 腫 菌 M01、M02 和 M03 表現(xiàn)出抗性，其中 CR004 和 CR007 只含有抗病基因CRk，CR013 含有抗病基因 CRa、 CRbkato、 CRk 和Crr3，CR015 和 CR016 含有抗病基因 CRa、 CRbkato和 Crr3；材料 CR021 只抗根腫菌 M01 且含有抗病基因 Crr2 和 CRk，材料 CR023 只抗根腫菌 M02 且含有抗病基因 CRc 和 CRk。3 結(jié)論與討論明確根腫菌各生理小種在我國不同地區(qū)的分布，對提高抗病品種選育的效率具有非常重要的意義。根腫菌存在生理小種的分化，目前已經(jīng)鑒定出的生理小種超過 24 個（孫保亞 等，2005）。我國主要的生理小種有 2 號、4 號、7 號、10 號和 11 號，其中以 4 號生理小種為主（沈向群 等，2009；丁云花 等，2013）。彭沙莎等（2013）鑒定出湖南大白菜根腫菌生理小種有 1 號、4 號、9 號和 13 號；劉峰等（2013）鑒定出云南和西藏大白菜根腫菌生理小種有 1 號、2 號、4 號、6 號、7 號、10 號、11 號和12 號；李寧等（2015）鑒定出陜西太白縣根腫菌生理小種為 7 號。因此，明確抗源對不同生理小種或不同地區(qū)生理小種的抗性對育種工作十分重要。分子標(biāo)記在輔助選擇育種、遺傳多樣分析和基因定位及克隆等方面的應(yīng)用具有十分明顯的優(yōu)越性（McCouch etal.，1997；Liu etal.，2013）。孫保亞等（2005）從國外引進(jìn)的大白菜品種中分離出48個抗根腫病大白菜自交系；樸鐘云等（2010）通過分子標(biāo)記輔助選擇的方法加速回交選育，培育出大白菜優(yōu)良自交系 BJN3 的 9 份抗根腫病近等基因系。Matsumoto 等（2012）利用分子標(biāo)記輔助選擇和傳統(tǒng)育種相結(jié)合的方法實現(xiàn)了 3 個抗根腫病基因CRa、 CRc 和 CRk 的聚合，并證明了聚合之后作物的抗病能力有所加強。本試驗中，抗病基因 CRk、Crr1 和 Crr2 也存在于感病材料中，筆者推測這3個基因?qū)Σ牧系目共⌒詻]有貢獻(xiàn)。材料CR012、CR014和CR018對根腫菌M01和M02表現(xiàn)出抗性，其中 CR012 含有抗病基因 CRa 和 CRbkato，CR014和 CR018 含有抗病基因 CRa、 CRbkato和 CRk，由此推測材料對M01和M02的抗性可能與 CRa 或CRbkato有關(guān)，也可能與兩者都有關(guān)。材料 CR013、CR015 和 CR016 對 根 腫 菌 M01、M02 和 M03 都表現(xiàn)出抗性，其中CR013含有抗病基因 CRa、CRbkato、 CRk 和 Crr3，CR015 和 CR016 含有抗病基因 CRa、 CRbkato和 Crr3，推測基因 Crr3 對 M03 具有特異抗性。材料 CR023 只抗根腫菌 M02 且含有抗病基因 CRc 和 CRk，因此認(rèn)為基因 CRc 可能對M02 具有特異抗性。CR004、CR007 和 CR021 是 3份比較特殊的材料，其中 CR004 和 CR007 對根腫菌M01、M02和M03都表現(xiàn)出抗性但只含有抗病基因 CRk，CR021只抗根腫菌M01且含有抗病基因 Crr2 和 CRk；由于本試驗感病材料中也含有基因 Crr2 和 CRk，因此推測這3份材料中可能還含有其他抗病基因，有待進(jìn)一步研究。本試驗對 24 份大白菜材料進(jìn)行接種鑒定，首次明確了它們對 3 個不同地區(qū)根腫菌的抗性，并篩選出 10 份抗病材料。同時，利用已經(jīng)開發(fā)出的與抗病基因連鎖的分子標(biāo)記對 24 份材料進(jìn)行了分子鑒定，明確了與材料抗病性相關(guān)的基因，對今后抗病材料的篩選和抗病基因的分子聚合育種具有較高的參考價值。參考文獻(xiàn)柴阿麗，朱發(fā)娣，王惟萍，石延霞，謝學(xué)文，李寶聚2015十字花科根腫病接種技術(shù)及發(fā)病條件研究華北農(nóng)學(xué)報，（S1）：266-271丁云花，簡元才，余陽俊，汪維紅，耿麗華，康俊根2013我國8 省市十字花科蔬菜根腫菌生理小種的鑒定中國蔬菜，（16）：85-88李寧，趙利民，魚昭君，陳紅紅，惠麥俠2015大白菜品種對陜西省太白縣根腫病的抗性鑒定中國農(nóng)學(xué)通報，31（34）：173-176劉峰，張麗輝，姬廣海2013 云南和西藏十字花科蔬菜根腫菌生理小種鑒定中國蔬菜，（20）：77-78彭沙莎，任佐華，黃小莉，劉敏捷，孫良菲，劉二明2013湖南十字花科作物根腫菌生理小種鑒定長江蔬菜，（6）：46-49樸鐘云，吳迪，王淼，張騰2010大白菜抗根腫病近等基因系的分子標(biāo)記輔助選育園藝學(xué)報，37（8）：1264-1272沈向群，聶凱，吳瓊，張玉光，孟星河2009大白菜根腫病主要生理小種種群分化鑒定初報中國蔬菜，（8）：59-62孫保亞，沈向群，郭海峰，周永紅2005十字花科植物根腫病及抗病育種研究進(jìn)展中國蔬菜，（4）：34-37王彤彤，張淑江，章時蕃，李菲，張慧，孫日飛2012大白菜根腫病抗性基因的標(biāo)記和定位中國蔬菜，（14）：31-35楊永林1990十字花科蔬菜根腫病抑菌型土壤初探植物保護學(xué)43新優(yōu)品種栽培管理本期視點產(chǎn)業(yè)市場病蟲防控 研究論文中 國 蔬 菜 &nbsp; &nbsp; CHINA VEGETABLES報，17（2）：127-131ChenJ，Jing J，Zhan Z2013Identification ofnovelQTLsforisolate-specificpartialresistancetoPlasmodiophora brassicain Brassica rapaPLoSOne，8（12）：e85307ChenL，ZhangX，XuH2016Introgressionofclubrootresistanceintoanelitepakchoiinbredlinethroughmarker-assistedintrogressionbreedingPlantBreeding，135（4）：471-475ChuM，Song T，falk K，Zhang X，Liu X，Chang A2014Fine mappingofRcr1andanalysesofitseffectontranscriptomepatternsduringinfectionbyPlasmodiophora brassicaeBMC Genomics， 10.1186/1471-2164-15-1166GaoF，Hirani AH，Liu J，Liu Z，F(xiàn)u G，Wu C，Peter BE，McVettyPBE，Li G2014Fine mappingaclubrootresistancelocusinChinesecabbageJAmerSocHortSci，139（3）：247-252HatakeyamaK，Niwa T，Kato T，Ohara T，Kakizaki T，Matsumoto S2017The tandemrepeatedorganizationofNB-LRRgenesintheclubroot-resistantCRblocusinBrassica rapaLMolecular GeneticsandGenomics292（2）：397-405HayashidaN，Takabatake Y，Nakazawa N2008Construction ofapracticalSCARmarkerlinkedtoclubrootresistanceinChinesecabbage，with intensiveanalysisofHC352bgenesJournal oftheJapaneseSocietyforHorticulturalScience，77（2）：150-154HiraiM，Harada T，Kubo N，sukada M，Suwabe K，Matsumoto S2004A novellocusforclubrootresistanceinBrassica rapaanditslinkagemarkersTheoretical andAppliedGenetics，108（4）：639-643KarlingJS1968The plasmodiophorales：including acompletehostindex，bibliography，and adescriptionofdiseasescausedbyspeciesofthisorderMolecular Biology&amp;Evolution，22（3）：582-588KatoT，Hatakeyama K，F(xiàn)ukino N，Matsumoto S2013Fine mappingoftheclubrootresistancegeneCRbanddevelopmentofausefulselectablemakerinBrassica rapaBreedingSci，6（3）：116-124KawamuraK，Shimizu M，Kawanabe T2017Assessment ofDNAmarkersforseedcontaminationtestingandselectionofdiseaseresistanceincabbageEuphytica，213（1）：28KuginukiY，Yoshikawa H，Hirai M1999Variation invirulenceofPlasmodiophora brassicaeinJapantestedwithclubroot-resistantcultivarsofChinesecabbage（ Brassica rapaL ssp.pekinensis）European JournalofPlantPathology，105（4）：327-332LiuB，WangY，ZhaiW，DengJ，WangH，CuiY，ChengF，WangXW，WuJ2013Development ofInDelmarkersforBrassica rapabasedonwhole-genomere-sequencingTheoretical andAppliedGenetics，126（1）：231-239MatsumotoES，Ueno HS，Aruga D2012Accumulation ofthreeclubrootresistancegenesthroughmarker-assistedselectioninChinesecabbage（ Brassica rapassp.pekinensis）Journal oftheJapaneseSocietyforHorticulturalSciences，81（2）：184-190McCouchSR，Chen X，Panaud O1997Microsatellite markerdevelopment，mapping andapplicationsinricegeneticsandbreedingPlantMolecularBiology，35：89-99MurrayMG，Thompson WF1980Rapid isolationofhigh-molecularweightplantDNANucleicAcidsResearch，8：4321-4325PiaoZY，Deng YQ，Choi SR2004SCAR andCAPSmappingofCRb，a geneconferringresistancetoPlasmodiophorabrassicaeinChinesecabbage（ Brassica rapassp.pekinensis）Theoretical andAppliedGenetics，108（8）：1458-1465SaitoM，Kubo N，Matsumoto S，Suwabe K，Tsukada M，Hirai M2006Fine mappingoftheclubrootresistancegene， crr3，in Brassica rapaTheorApplGenet，114：81-91SakamotoK，Saito A，Hayashida N，Taguchi G，Matsumoto E2008Mapping ofisolate-specificQTLsforclubrootresistanceinChinesecabbage（ Brassica rapaL.ssp.pekinensis）Theoretical andAppliedGenetics，117（5）：759-767SuwabeK，Tsukazaki H，Lketani H2003Identification oftwolociforresistancetoclubroot（ Plasmodiophoru brassicae Worenin）in Brassica rapa LTheoretical andAppliedGenetics，107（6）：997-1002SuwabeK，Tsukazaki H，Iketani H，Hatakeyama K，Kondo M，F(xiàn)ujimuraM，Nunome T，F(xiàn)ukuoka H，Hirai M，Matsumoto S 2006Simplesequencerepeat-basedcomparativegenomicsbetweenBrassica rapa andArabidopsis thaliana：the geneticoriginofclubrootresistanceGenetics，173（1）：309-319UenoH，Matsumoto E，Aruga D，Kitagawa S，Matsumura H，HayashidaN2012Molecular characterizationoftheCRageneconferringclubrootresistanceinBrassica rapaPlant MolBiol，80：621-629ZhangT，Zhao Z，Zhang C2014Fine geneticandphysicalmappingoftheCRb geneconferringresistancetoclubrootdiseaseinBrassica rapaMolecularBreeding，34（3）：1173-1183ZhangH，F(xiàn)eng J，Zhang S2015Resistance toPlasmodiophora brassicaeinBrassica rapaandBrassica juncea genotypesfromChinaPlantDisease，99（6）：776-779Anti-sources Screening and Molecular Marker Identification of Chinese Cabbage Against Clubroot ZHUMing-zhao，ZHANG Shu-jiang，ZHANG Hui，ZHANG Shi-fan，LI Fei，WANG Xiao-wu，WU Jian，LIGuo-liang，WEIYun-xiao，YUELi-xin，SUNRi-fei*（ InstituteofVegetablesandFlowers， ChineseAcademyofAgriculturalSciences， Beijing100081， China）44新優(yōu)品種栽培管理本期視點產(chǎn)業(yè)市場病蟲防控 研究論文中 國 蔬 菜 &nbsp; &nbsp; CHINA VEGETABLES黃瓜棒孢葉斑病病原菌RFP標(biāo)記轉(zhuǎn)化株的構(gòu)建謝學(xué)文 張自心 武 軍 石延霞 柴阿麗 李寶聚*（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）摘 要：由多主棒孢（ Corynespora cassiicola）侵染引起的黃瓜棒孢葉斑病已成為我國黃瓜生產(chǎn)上的重要新流行病害，目前尚缺乏抗性品種，病原菌侵染機制及與寄主的互作關(guān)系尚不清楚。為了開展多主棒孢的病原學(xué)研究，本試驗采用農(nóng)桿菌基因介導(dǎo)技術(shù)（ATMT），獲得了紅色熒光蛋白（RFP）標(biāo)記的多主棒孢轉(zhuǎn)化株，轉(zhuǎn)化株在 PDA 培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接 6 次后仍能在菌絲和分生孢子上發(fā)出強烈的紅色熒光，生物學(xué)測定和致病性測定結(jié)果表明該轉(zhuǎn)化株與野生型菌株無顯著差異。關(guān)鍵詞：黃瓜棒孢葉斑病；多主棒孢；農(nóng)桿菌介導(dǎo)法；RFP染逾530種植物。國內(nèi)外有關(guān)該病菌的研究主要集中在生物學(xué)特性、遺傳穩(wěn)定性和抗藥性等方面（Dixonetal.，2009；Miyamotoetal.，2010；高葦?shù)龋?012；李寶聚 等，2012；Déon etal.，2014），對多主棒孢致病機理及侵染途徑方面研究較少。紅色熒光蛋白（red fluorescentprotein，RFP）最早從印度洋 - 太平洋地區(qū)的珊瑚蟲中分離而得，在不同溫度和 pH 條件下具有較高的穩(wěn)定性，且與其他蛋白形成的融合蛋白通常仍具有熒光，因其具有易于檢測、熒光穩(wěn)定、無毒害、種屬通用、易于構(gòu)建載體、可進(jìn)行活細(xì)胞定位定時觀察等特性而得到廣泛關(guān)注（Lorang etal.，2001）。RFP 隨機插入真菌基因組中，可直觀、快速、簡便地動態(tài)觀察謝學(xué)文，助理研究員，專業(yè)方向：植物病理學(xué)，E-mail：xiexuewencaas.cn * 通訊作者（Corresponding author）：李寶聚，研究員，博士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：蔬菜病害綜合防治，E-mail：libaojucaas.cn收稿日期：2017-10-24；接受日期：2017-12-06基金項目 ：國家自然科學(xué)基金項目（31401888），國家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（CARS-25）黃瓜（ Cucumis sativus L.）是我國重要的蔬菜作物之一，種植面積居世界首位，且逐年增加。近幾年，由多主棒孢（ Corynespora cassiicola）侵染引起的黃瓜棒孢葉斑病成為危害我國黃瓜生產(chǎn)的重要新流行病害（李寶聚 等，2008；韓小爽 等，2011；楊雙娟 等，2012），危害范圍和程度甚至超過霜霉病和白粉病。該菌寄主范圍廣泛，能夠侵Abstract：Twenty-four Chinesecabbage（ Brassica rapa L.ssp.chinensis）materials wereinoculatedwith3kindsofPlasmodiophora brassicaeM01，M02 andM03，and allthelineswereidentifiedbymolecularmarkersinordertoobtainexcellentanti-sourcesandtoconfirmallmaterialscontainingdiseaseresistantgenes.Theresultsshowedthattherew</p>