長(zhǎng)期施肥對(duì)葡萄土壤細(xì)菌群落多樣性及ARGs分布的影響.pdf

中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào) 中英文 2025 27 6 229null239 Journal of Agricultural Science and Technology 長(zhǎng)期施肥對(duì)葡萄土壤細(xì)菌群落多樣性及ARGs分布的影響 王會(huì)來(lái) 1 李帥 2 王寅 1 吳東濤 3 馬嘉偉 4 葉正錢 2 池永清 3 王美 5 1 麗水市蓮都區(qū)土肥能源發(fā)展中心 浙江 麗水 323000 2 浙江農(nóng)林大學(xué) 浙江省土壤污染生物修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn) 室 杭州 311300 3 麗水市土肥植保能源總站 浙江 麗水 323000 4 浙江農(nóng)林大學(xué)茶學(xué)與茶文化學(xué)院 杭州 311300 5 浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 杭州 311300 摘 要 為研究長(zhǎng)期施肥對(duì)葡萄土壤微生物群落多樣性與抗生素耐藥基因 antibiotics resistance genes ARGs 的 影響 以連續(xù)施肥5年的葡萄土壤為研究對(duì)象 并以鄰近無(wú)種植且未施肥的地塊表層土壤作為對(duì)照 CK 結(jié)合宏 基因組測(cè)序技術(shù)和土壤理化性質(zhì)分析 系統(tǒng)研究長(zhǎng)期施肥對(duì)葡萄土壤微生物群落多樣性及ARGs分布的影響 結(jié)果表明 與CK相比 長(zhǎng)期施肥顯著降低了土壤pH 且土壤養(yǎng)分含量也發(fā)生了顯著變化 其中土壤有機(jī)質(zhì) 全 氮和全鉀含量分別增加236 0 243 3 和7 4 堿解氮和銨態(tài)氮含量分別提升9 61和9 28倍 土壤微生物生物 量碳和微生物生物量氮分別增加19 2 和8 53倍 此外 與CK相比 長(zhǎng)期施肥使葡萄土壤中新增218種特定耐 藥基因 減少86種天然耐藥基因 在土壤pH 有機(jī)質(zhì) 全氮 全鉀等理化因素的驅(qū)動(dòng)下 硝化螺旋菌屬 Nitrospira 和厭氧粘細(xì)菌屬 Anaeromyxobacter 的相對(duì)豐度分別降低11 4 和3 1 而假纖細(xì)芽孢桿菌屬 Pseudogracilibacillus 葡萄球菌屬 Staphylococcus 假雙頭斧形菌屬 Pseudolabrys 和枝芽胞桿菌屬 Virgibacillus 的相對(duì)豐度分別增加10 5 6 1 0 6 和5 4 這些優(yōu)勢(shì)菌群的變化與耐藥基因存在密切聯(lián) 系 且參與調(diào)節(jié)葡萄土壤菌群的整體功能與代謝 綜上所述 長(zhǎng)期施肥顯著改善了葡萄土壤的理化性質(zhì) 同時(shí)對(duì) 土壤微生物群落多樣性和ARGs數(shù)量產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響 關(guān)鍵詞 葡萄土壤 長(zhǎng)期施肥 土壤微生物群落 抗生素抗性基因 ARGs 分布規(guī)律 doi 10 13304 j nykjdb 2024 0675 中圖分類號(hào) S15 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1008 0864 2025 06 0229 11 Effect of Long term Fertilization on Diversity of Bacterial Community and Distribution of ARGs in Grape Soil WANG Huilai 1 LI Shuai 2 WANG Yin 1 WU Dongtao 3 MA Jiawei 4 YE Zhengqian 2 CHI Yongqing 3 WANG Mei 5 1 Soil Fertilizer and Rural Energy Development Center of Liandu District in Lishui City Zhejiang Lishui 323000 China 2 Key Laboratory of Soil Contamination Bioremediation of Zhejiang Province Zhejiang A F University Hangzhou 311300 China 3 Soil Fertilizer and Plant Protection and Energy Sources Station of Lishui City Zhejiang Lishui 323000 China 4 College of Tea Science and Tea Culture Zhejiang A F University Hangzhou 311300 China 5 College of Animal Science and Technology College of Veterinary Medicine Zhejiang A F University Hangzhou 311300 China Abstract To examine the influence of longnullterm fertilization on the diversity of microbial community and the evolution of antibiotic resistance genes ARGs in grape soil the grape soil continuously fertilized for 5 years was as material with an adjacent plot of uncultivated and unfertilized soil as control CK Metagenomic sequencing technology and analysis of the physicochemical properties of the soil were employed to conduct a comprehensive investigation into the impact of longnullterm fertilization on the diversity of the microbial community and the distribution 收稿日期 2024 08 19 接受日期 2025 02 10 基金項(xiàng)目 浙江農(nóng)林大學(xué)人才啟動(dòng)項(xiàng)目 2023LFR014 聯(lián)系方式 王會(huì)來(lái) Enullmail sjw8515 通信作者 池永清 Enullmail 787795300 王美 Enullmail meiwang 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào) 中英文 27 卷 of ARGs in grape soil The results revealed that compared with CK longnullterm fertilization resulted in a notable reduction of soil pH and a substantial alteration in soil nutrient composition The contents of soil organic matter total nitrogen and total potassium increased by 236 0 243 3 and 7 4 respectively Furthermore the contents of alkalinullsoluble nitrogen and ammonium nitrogen increased significantly by 9 61 and 9 28 times respectively Additionally the soil microbial biomass carbon and microbial biomass nitrogen increased by 19 2 and 8 53 times respectively Furthermore compared with CK longnullterm fertilization resulted in the addition of 218 new specific drug resistance genes and the reduction of 86 natural drug resistance genes in grape soil The relative abundances of the genera Nitrospira and Anaeromyxobacter were decreased by 11 4 and 3 1 respectively as a consequence of the influence of physical and chemical factors such as soil pH organic matter total nitrogen and total potassium The relative abundances of the genera Pseudogracilibacillus Staphylococcus Pseudolabrys and Virgibacillus increased by 10 5 6 1 0 6 and 5 4 respectively These changes in dominant bacterial groups were closely related to ARGs and played a role in regulating the overall function and metabolism of the grape soil microbiota In conclusion longnullterm fertilization could markedly enhance the physical and chemical properties of grape soil while also should exert a profound influence on the diversity of soil microbial community and the number of ARGs Key words grape soil longnullterm fertilization soil microbial community antibiotic resistance genes ARGs distribution patterns 葡萄作為一種經(jīng)濟(jì)作物 不僅在國(guó)際市場(chǎng)上 占有重要地位 也為人們提供了豐富的營(yíng)養(yǎng) 中 國(guó)葡萄總產(chǎn)量位居世界第1 種植面積位居第2 1 土壤作為葡萄樹生長(zhǎng)的基礎(chǔ) 其結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì) 在長(zhǎng)期施肥下會(huì)發(fā)生顯著變化 從而影響土壤微 生物群落的組成和功能 特別是在果農(nóng)長(zhǎng)期高強(qiáng) 度經(jīng)營(yíng)條件下 土壤細(xì)菌群落多樣性的變化對(duì)土 壤養(yǎng)分循環(huán)及果樹生長(zhǎng)都有重要影響 土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部 分 參與并影響土壤結(jié)構(gòu) 養(yǎng)分循環(huán) 有機(jī)物分解 以及礦物質(zhì)養(yǎng)分釋放等關(guān)鍵過(guò)程 2 土壤微生物 群落結(jié)構(gòu)受多種因素調(diào)控 其中土壤pH是影響其 群落結(jié)構(gòu)的重要因素 研究表明 中等pH的土壤 具有較高的細(xì)菌多樣性 而酸性或堿性的土壤環(huán) 境則會(huì)顯著降低細(xì)菌多樣性 3 此外 土壤養(yǎng)分組 成直接影響微生物群落的代謝 導(dǎo)致土壤微生物 結(jié)構(gòu)發(fā)生變化 4 例如 施肥會(huì)導(dǎo)致土壤的碳氮比 C N 失衡 限制微生物可利用的碳源 進(jìn)而改變 土壤微生物群落結(jié)構(gòu) 5 長(zhǎng)期施用化肥 尤其是氮 肥 會(huì)加速土壤酸化 并導(dǎo)致硝態(tài)氮在土壤中累 積 不僅會(huì)改變土壤環(huán)境 還可能引起抗生素耐藥 基因 antibiotics resistance genes ARGs 的富集 6 7 ARGs在抗生素被發(fā)現(xiàn)之前就廣泛存在于土 壤中 8null10 近年來(lái) 研究表明 ARGs可通過(guò)食物鏈 傳播至人體 從而降低抗生素治療的有效性 嚴(yán)重 威脅人類健康 11 據(jù)報(bào)道 2014年全球每年死于 抗生素耐藥病原體引發(fā)疾病的人數(shù)為70萬(wàn) 至 2050年將上升至1 000萬(wàn) 12 微生物是ARGs的載 體 ARGs能夠通過(guò)細(xì)菌間的直接接觸 噬菌體轉(zhuǎn) 導(dǎo)以及自然轉(zhuǎn)化等機(jī)制在微生物群體間擴(kuò)散 13null15 土壤是ARGs的重要儲(chǔ)存庫(kù) 研究表明 施肥會(huì)導(dǎo) 致土壤中ARGs的富集 16null18 因此 研究施肥條件 下的土壤微生物群落與ARGs之間的互作關(guān)系對(duì) 揭示ARGs在土壤中的傳播機(jī)制至關(guān)重要 近年來(lái) 關(guān)于施肥對(duì)葡萄園影響的研究主要 集中在肥料類型和果實(shí)品質(zhì)上 韓建等 19 探討了有 機(jī)肥對(duì)葡萄品質(zhì)和土壤環(huán)境的影響 王小龍等 20 研 究了有機(jī)肥對(duì)葡萄樹根系及土壤養(yǎng)分的作用 李 文超等 21 分析了不同土壤條件對(duì)釀酒葡萄生理及 果實(shí)品質(zhì)的影響 然而 針對(duì)葡萄土壤中微生物 群落和ARGs分布及其相關(guān)性的研究相對(duì)匱乏 因此 本研究以浙江省某葡萄果園為典型樣地 探 討長(zhǎng)期施肥對(duì)葡萄土壤微生物群落多樣性與 ARGs的影響 以期為評(píng)估農(nóng)業(yè)活動(dòng)對(duì)環(huán)境的潛在 影響 優(yōu)化農(nóng)田管理以及實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提 供科學(xué)依據(jù) 1 材料與方法 1 1 試驗(yàn)區(qū)概況及試驗(yàn)材料 試驗(yàn)區(qū)位于浙江省麗水市蓮都區(qū) 28 26 45 N 119 54 46 E 地處中亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū) 氣候 溫暖濕潤(rùn) 雨量充沛 四季分明 具有典型的山地 立體氣候特征 該區(qū)域年均氣溫18 1 年均降 水量1 427 mm 葡萄是當(dāng)?shù)刂饕乃a(chǎn)業(yè)之一 采樣點(diǎn)位于該區(qū)域內(nèi)的某典型葡萄果園 該果園已 230 6 期 王會(huì)來(lái)等 長(zhǎng)期施肥對(duì)葡萄土壤細(xì)菌群落多樣性及ARGs分布的影響 連續(xù)施肥5年 施肥模式包括 基肥 15null15null15 1 0 kg hm 2 年 1 商品有機(jī)肥53 3 kg hm 2 年 1 催芽肥 15null15null15 1 7 kg hm 2 年 1 膨果肥 16null6null 24 2 0 kg hm 2 年 1 采樣點(diǎn)栽培的葡萄品種為 陽(yáng)光玫瑰 種植年限為10年 采集葡萄樹周圍 0 20 cm的表層土壤為研究對(duì)象 PT 以無(wú)種植 且未施肥的地塊表層土壤作為對(duì)照 CK 每處 理采集3個(gè)重復(fù)樣本 并將土壤分為3部分進(jìn)行后 續(xù)分析 一部分土壤儲(chǔ)存在4 條件下 用于測(cè)定 銨態(tài)氮 微生物生物量碳及微生物生物量氮 一部 分土壤置于 80 保存 用于提取DNA 一部分土 壤在室溫下風(fēng)干 過(guò)2 mm篩后用于分析pH 有機(jī) 質(zhì) 堿解氮 全氮和全鉀等理化指標(biāo) 1 2 土壤理化性質(zhì)測(cè)定 土壤理化性質(zhì)的測(cè)定參照 土壤農(nóng)化分 析 22 按照土水質(zhì)量比1 5使用pH計(jì) PHSnull3C 上海利達(dá)儀器廠 中國(guó) 測(cè)定土壤pH 采用靛酚藍(lán) 法測(cè)定土壤銨態(tài)氮 NH 4 nullN 含量 采用重鉻酸鉀 容量法測(cè)定土壤有機(jī)質(zhì) soil organic matter SOM 含量 采用H 2 SO 4 消煮 凱氏蒸餾法測(cè)定土壤全氮 total nitrogen TN 含量 采用NaOH熔解 火焰光 度法測(cè)定土壤全鉀 total potassium TK 含量 采 用堿解擴(kuò)散法測(cè)定土壤堿解氮 alkalinullhydrolyzable nitrogen AN 含量 采用氯仿熏蒸浸提法測(cè)定土 壤微生物生物量碳 microbial biomass carbon MBC 和微生物生物量氮 microbial biomass nitrogen MBN 含量 1 3 土壤DNA提取及宏基因組測(cè)序 取出存放于 80 的土壤樣本 使用HiPure Soil DNA Mini Kit土壤DNA提取試劑盒從0 5 g土 壤樣本中提取DNA 使用NanoDrop分光光度計(jì) ND1000 Thermo Scientific Wilmington DE 檢測(cè) DNA質(zhì)量 將質(zhì)量合格的DNA樣品 OD260 280為 1 8 2 0 DNA 總量 1 g 采用 NEBNext Ultra TMDNA Library Prep Kit for llumina New England Biolabs MA USA 構(gòu)建雙端 pairednullend PE 文庫(kù) 通過(guò)Agilent 2100 Agilent Technologies CA USA 檢測(cè)文庫(kù)的插入片段大小 并使用qPCR方法準(zhǔn) 確定量文庫(kù)的有效含量 3 nmoL L 1 文庫(kù)合 格后 利用lumina HiSeq PE150平臺(tái) lumina CA USA 進(jìn)行宏基因組測(cè)序 1 4 數(shù)據(jù)分析 利用 SPSS 19 0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)差異 顯著分析 采用單樣本t檢驗(yàn)比較各指標(biāo)之間的 顯著性差異 使用Origin2021軟件制圖 2 結(jié)果與分析 2 1 長(zhǎng)期施肥下葡萄土壤理化性質(zhì)的變化分析 由表1可知 施肥后的葡萄土壤與CK在各項(xiàng) 土壤基本理化指標(biāo)上均存在顯著差異 與CK相 比 葡萄土壤的pH降低1 87 SOM含量增加 236 0 AN和NH 4 nullN含量分別是CK的9 61和 9 28倍 葡萄土壤的TN含量為2 85 g kg 1 比CK 高243 3 TK含量為31 34 mg kg 1 比CK高 7 4 此外 葡萄土壤的MBC含量比CK高19 2 MBN含量為111 98 mg kg 1 是CK的8 53倍 綜 上所述 長(zhǎng)期施肥顯著增加了土壤有機(jī)質(zhì) 全量養(yǎng) 分 有效養(yǎng)分 微生物生物量碳和微生物生物量氮 的含量 表明長(zhǎng)期施肥能夠改善葡萄土壤的理化 性質(zhì) 2 2 長(zhǎng)期施肥下葡萄土壤微生物與ARGs數(shù)量 的變化分析 長(zhǎng)期施肥條件下的葡萄土壤中可檢測(cè)的微生 物菌科和耐藥基因數(shù)量如圖1所示 與CK相比 葡萄土壤中的菌科數(shù)量減少了23種 增加了12種 表 1 葡萄土壤的基本理化性質(zhì) Table 1 Basic physicochemical properties of grape soils 處理 Treatment PT CK pH 5 65 0 07 a 7 52 0 03 b 有機(jī)質(zhì)SOM g kg 1 44 83 2 45 a 13 35 2 53 b 堿解氮AN mg kg 1 605 32 15 64 a 62 99 4 60 b 氨態(tài)氮NH 4 null N mg kg 1 71 17 3 77 a 7 67 1 30 b 全氮TN g kg 1 2 85 0 06 a 0 83 0 06 b 全鉀TK mg kg 1 31 34 0 64 a 29 18 0 81 b 土壤微生物量 碳MBC mg kg 1 117 89 0 48 a 98 87 4 85 b 土壤微生物量 氮MBN mg kg 1 111 98 3 18 a 11 75 1 64 b 注 同列不同小寫字母表示不同處理間在P 0 05水平差異顯著 Note Different lowercase letters indicate significant differences between different treatments at P 0 05 level 231 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào) 中英文 27 卷 特異性菌科 這可能是由于不同處理下土壤差異 所致 葡萄土壤與CK共檢測(cè)659種耐藥基因 與CK相比 葡萄土壤的耐藥基因數(shù)量增加了 29 3 此外 葡萄土壤增加了218種特定耐藥基 因 減少了86種天然耐藥基因 表明耐藥基因在 土壤中廣泛存在 2 3 長(zhǎng)期施肥下葡萄土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化 分析 施肥下的葡萄土壤和CK中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落 豐度位于前20 的相對(duì)豐度如圖2所示 在門水 平上 葡萄土壤和CK中相對(duì)豐度較高的菌門均 為假單胞菌門 Pseudomonadota 酸桿菌門 Acidobacteriota 和芽孢桿菌門 Bacillota 其中 Bacillota在不同處理下的相對(duì)豐度差異較大 其 在葡萄土壤中的相對(duì)豐度較CK高18 9 在綱 水平 葡萄土壤中的主要菌綱為桿菌綱 Bacilli null變形菌綱 AlphanullProteobacteria null變形菌綱 BetanullProteobacteria 放線菌綱 Actinomycetes 其相對(duì)豐度總和達(dá)68 6 CK的主要菌綱是 null變 形菌綱 BetanullProteobacteria Terriglobia null變形菌 綱 AlphanullProteobacteria 和 null變形菌綱 Deltanull Proteobacteria 其相對(duì)豐度總和為67 7 葡萄 土壤與CK的主要菌綱存在顯著差異 葡萄土壤 中Bacilli和AlphanullProteobacteria的相對(duì)豐度顯著 高于CK 而BetanullProteobacteria Terriglobia和Deltanull Proteobacteria的相對(duì)豐度顯著低于CK 其中葡萄 土壤中Bacilli和AlphanullProteobacteria的相對(duì)豐度較 CK分別增加25 1 和8 7 而BetanullProteobacteria Terriglobia和DeltanullProteobacteria的相對(duì)豐度較 CK分別降低9 0 12 9 和8 7 在屬水平 除 未分類的菌屬外 葡萄土壤和CK中相對(duì)豐度差 異最大的菌屬為硝化螺旋菌屬 Nitrospira 其在葡 萄土壤中的相對(duì)豐度為2 4 較CK降低11 4 其 次是假纖細(xì)芽孢桿菌屬 Pseudogracilibacillus 它 在葡萄土壤中的相對(duì)豐度為10 6 較CK提高 10 5 此外 葡萄土壤中的葡萄球菌屬 Staphylococcus 假雙頭斧形菌屬 Pseudolabrys 枝芽胞桿菌屬 Virgibacillus 的相對(duì)豐度較CK分 別提高6 1 0 6 和5 4 而厭氧粘細(xì)菌屬 Anaeromyxobacter 和纖線桿菌屬 Ktedonobacte 的相對(duì)豐度較CK分別降低3 1 和2 9 綜上 表明 長(zhǎng)期施肥顯著影響了葡萄土壤微生物群落 的結(jié)構(gòu)及其相對(duì)豐度 2 4 長(zhǎng)期施肥下葡萄土壤ARGs的分布特征 分析 圖3A展示了葡萄土壤和CK土壤中的優(yōu)勢(shì)耐 藥基因類別及相對(duì)豐度 在2種處理下相對(duì)豐度 占比較高的前4種耐藥基因類別均為多藥耐藥類 multidrug 大環(huán)內(nèi)酯類 MLS 四環(huán)素類 tetracycline 和糖肽類 glycopeptide 這4類在葡 萄土壤和CK中的相對(duì)豐度總和分別為75 4 和 79 1 其中多藥耐藥類的相對(duì)豐度最高 分別 為41 7 葡萄土壤 和46 8 CK對(duì)照 其次是 大環(huán)內(nèi)酯類 其在葡萄土壤和CK中的相對(duì)豐度 分別為15 2 和12 7 由此表明 盡管2種處理 下土壤的優(yōu)勢(shì)耐藥基因類別在結(jié)構(gòu)上相似 但其 相對(duì)豐度存在顯著差異 為了進(jìn)一步揭示葡萄土壤與CK在ARGs上 的差異 對(duì)相對(duì)豐度前20的優(yōu)勢(shì)耐藥基因進(jìn)行分 析 結(jié)果 圖3B 表明 除未被分類的耐藥基因外 葡萄土壤與CK中相對(duì)豐度最高的耐藥基因是 macB和tetA 58 macB在葡萄土壤和CK的相對(duì) 豐度分別為7 6 和8 2 tetA 58 的相對(duì)豐度分 別為4 4 和4 9 此外 除bcrA msbA patA efrA TaeA和novA基因在葡萄土壤中的相對(duì)豐度高于 A 菌科數(shù)量 B 耐藥基因數(shù)量 A Number of mycofamilies B Number of resistance genes 圖1 不同處理下土壤中的可檢測(cè)菌科數(shù)量和 耐藥基因數(shù)量 Fig 1 Number of mycogens and drugnullresistant genes detected under different treatments 232 6 期 王會(huì)來(lái)等 長(zhǎng)期施肥對(duì)葡萄土壤細(xì)菌群落多樣性及ARGs分布的影響 CK外 其余耐藥基因的相對(duì)豐度均低于CK 以 上結(jié)果表明 長(zhǎng)期施肥會(huì)顯著改變果園土壤中 ARGs的相對(duì)豐度 2 5 優(yōu)勢(shì)菌群對(duì)葡萄土壤微生物整體功能代謝 及ARGs的貢獻(xiàn)分析 土壤微生物是ARGs的重要攜帶者 研究耐 藥基因類別和菌屬的關(guān)系對(duì)于解析土壤微生物群 落和ARGs的相互作用具有重要意義 圖4A展 示了10種菌屬與4類耐藥基因之間的關(guān)系 在多 藥耐藥類和糖肽類中 葡萄土壤中Pseudolabrys的 貢獻(xiàn)率較CK分別高1 3 和1 5 通過(guò)葡萄土 壤中細(xì)菌群落在屬水平上的結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn) Anaeromyxobacter Ktedonobacter和Nitrospira在葡 萄土壤中相對(duì)豐度低于CK 而Pseudolabrys的相 對(duì)豐度高于CK 在耐藥類別的貢獻(xiàn)率方面 Anaeromyxobacter Ktedonobacter和Nitrospira也表 現(xiàn)出相同的趨勢(shì) 以上結(jié)果表明 葡萄土壤中的 耐藥基因類別與優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落的演變密切相關(guān) 圖4B展示了優(yōu)勢(shì)菌群與土壤微生物功能之 間的關(guān)系 與CK相比 葡萄土壤中優(yōu)勢(shì)菌群在 4種COG功能中的總貢獻(xiàn)率較低 具體而言 葡 萄土壤中的Nitrospira在E功能類的貢獻(xiàn)率為 1 0 比CK低10 5 在C功能類的貢獻(xiàn)率為1 9 比CK低13 1 在R功能類的貢獻(xiàn)率為1 7 比 CK低13 6 在T功能類的貢獻(xiàn)率為3 3 比CK 低15 2 此外 葡萄土壤中的Anaeromyxobacter 和Ktedonobacter也表現(xiàn)出與Nitrospira相似的趨勢(shì) 在4種COG功能中的貢獻(xiàn)率均低于CK 與此相 反 葡萄土壤中的Pseudolabrys在各功能類別中的 貢獻(xiàn)率均高于CK 其中在C功能類的貢獻(xiàn)率為 6 42 比CK高1 74 在R功能類的貢獻(xiàn)率為 3 93 比CK高0 82 在T功能類的貢獻(xiàn)率為 A 門水平 B 綱水平 C 屬水平 A Phylum level B Class level C Genus level 圖2 不同處理下土壤中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌 前20 的相對(duì)豐度 Fig 2 Relative abundance of dominant bacteria top 20 under different treatments 233 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào) 中英文 27 卷 3 05 比 CK 高 0 86 以 上 結(jié) 果 表 明 Anaeromyxobacter Ktedonobacter Nitrospira 和 Pseudolabrys在不同COG功能的貢獻(xiàn)率存在顯著 差異 圖4C展示了優(yōu)勢(shì)菌群與土壤微生物代謝之間 的關(guān)系 與CK相比 葡萄土壤中的Nitrospira在全 球和總覽圖譜 global and overview map 碳水化合 物代謝 氨基酸代謝和能量代謝中的貢獻(xiàn)率分別低 13 9 11 9 11 3 和13 5 Anaeromyxobacter 和Ktedonobacter也表現(xiàn)出與Nitrospira相同的趨勢(shì) 此外 葡萄土壤中的Pseudolabrys在全球和總覽圖 譜 氨基酸代謝和能量代謝的貢獻(xiàn)率分別比CK高 0 42 0 03 和1 56 表現(xiàn)出與Nitrospira相反的 趨勢(shì) 以上結(jié)果表明 長(zhǎng)期施肥下 其優(yōu)勢(shì)菌屬主 要在氨基酸代謝 細(xì)胞能量利用等復(fù)雜生化代謝中 發(fā)揮重要作用 3 討論 3 1 長(zhǎng)期施肥對(duì)葡萄土壤理化性質(zhì)的影響 施肥是提高果園收益的必要措施 本研究發(fā) 現(xiàn) 長(zhǎng)期施肥會(huì)使土壤pH降低 而有機(jī)質(zhì) 全氮和 全鉀含量顯著增加 在好氧條件下 施入的氮肥 主要是尿素 經(jīng)水解轉(zhuǎn)化為NH 4 并進(jìn)一步通過(guò) 硝化作用轉(zhuǎn)化為NO 3 這個(gè)過(guò)程伴隨著H 的釋放 隨著NO 3 的淋溶 導(dǎo)致土壤酸化 23 杜天宇等 24 發(fā)現(xiàn) 連續(xù)施肥7年的核桃樹根際土壤中的SOM TN和NH 4 nullN含量分別為CK處理的2 2 2 0和2 1 倍 而土壤pH較CK處理顯著降低 趙佐平等 25 研究表明 連續(xù)施肥7年后 蘋果園土壤的SOM含 量較CK處理提高29 3 臧逸飛等 26 研究表明 連續(xù)施肥26年后 土壤MBC含量較CK處理提升 55 8 MBN含量提升77 9 長(zhǎng)期施肥能改善土 壤的物理結(jié)構(gòu) 如增加土壤團(tuán)聚體含量 提高土壤 的總孔隙度 通氣孔隙度和保水能力 而良好的土 壤結(jié)構(gòu)有利于微生物生長(zhǎng)和活動(dòng) 進(jìn)而增加土壤 中的微生物生物量 27 28 此外 土壤SOM含量與 微生物生物量間存在良好的正相關(guān)性 這也是 MBN和MBC增加的重要原因 24 29 30 3 2 長(zhǎng)期施肥對(duì)葡萄土壤微生物群落的影響 土壤微生物是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部 分 其群落結(jié)構(gòu)受土壤中可利用養(yǎng)分的調(diào)控 4 研 究表明 長(zhǎng)期施肥會(huì)顯著影響土壤的理化性 質(zhì) 31null33 而土壤的理化性質(zhì)是影響微生物群落結(jié)構(gòu) 的關(guān)鍵因素 2 Shi等 34 研究指出 長(zhǎng)期施肥會(huì)影響 植物根際土壤環(huán)境變化 進(jìn)而導(dǎo)致根際功能微生 物群的富集 在長(zhǎng)期施肥下 葡萄土壤中 Pseudogracilibacillus Staphylococcus Virgibacillus Anaeromyxobacter Ktedonobacter Nitrospira 和 A 優(yōu)勢(shì)耐藥類別 B 優(yōu)勢(shì)耐藥基因 A Dominant drug resistance category B Dominant drug resistance genes 圖3 不同處理下的土壤微生物耐藥類別和耐藥基因豐度 Fig 3 Abundance and categories of dominant drug resistance genes under different treatments 234 6 期 王會(huì)來(lái)等 長(zhǎng)期施肥對(duì)葡萄土壤細(xì)菌群落多樣性及ARGs分布的影響 Pseudolabrys的相對(duì)豐度均發(fā)生了顯著變化 有 機(jī)肥的施用向土壤中引入大量外源微生物 35 Pseudogracilibacillus是有機(jī)肥腐熟過(guò)程中的關(guān)鍵 菌屬 36 長(zhǎng)期施加商品有機(jī)肥使得該菌屬在葡萄 土壤中的相對(duì)豐度高于CK Staphylococcus能夠 利用植物根系分泌的葡萄糖 蔗糖等物質(zhì) 并與 土壤有機(jī)碳含量呈正相關(guān) 37 長(zhǎng)期施肥增加了 土壤中的有機(jī)碳含量 而葡萄發(fā)達(dá)的根系也提 供了豐富的根系分泌物 二者共同促進(jìn)了 Staphylococcus的生長(zhǎng)與繁殖 從而使其在葡萄土 壤中的相對(duì)豐度高于CK Virgibacillus在高鹽環(huán) 境下具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力 且與土壤鹽分關(guān)系 密切 38 長(zhǎng)期施肥增加了葡萄土壤中的K 和 Na 含量 使土壤鹽含量發(fā)生變化 從而促進(jìn)了該 菌屬的生長(zhǎng) Anaeromyxobacter在土壤固氮過(guò)程 中起重要作用 其生長(zhǎng)的最佳pH為7 0 低pH環(huán) 境抑制其豐度 在長(zhǎng)期施肥下 土壤中易分解的 碳源增加 土壤有機(jī)質(zhì)分解加劇 代謝產(chǎn)物如有 機(jī)酸等可抑制Anaeromyxobacter活性 從而導(dǎo)致 其相對(duì)豐度降低 39null41 Ktedonobacter在土壤碳循 環(huán)中發(fā)揮重要作用 張佳音 42 研究發(fā)現(xiàn) 在化肥 和有機(jī)肥配施時(shí) Ktedonobacter的相對(duì)豐度下 降 這與本研究的結(jié)果一致 該菌屬在惡劣環(huán) 境中具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力 能夠在寡營(yíng)養(yǎng)環(huán)境 中占據(jù)主導(dǎo)地位 43 Nitrospira是土壤氮循環(huán)中 的關(guān)鍵菌屬 44 45 Ying等 46 研究表明 長(zhǎng)期施肥處 理下該菌屬的相對(duì)豐度低于CK處理 這可能 與Nitrospira對(duì)土壤酸化的高敏感性有關(guān) 47 48 長(zhǎng)期施肥導(dǎo)致葡萄土壤 pH 降低 抑制了 Nitrospira的生長(zhǎng) 使得該菌屬的相對(duì)豐度低于 CK 此外 Pseudolabrys的相對(duì)豐度與土壤中TN 和TK等養(yǎng)分含量呈正相關(guān) 34 由此可知 長(zhǎng)期 施肥通過(guò)降低土壤pH 增加SOM和TN TK等養(yǎng) 分含量 驅(qū)動(dòng)葡萄土壤中的Pseudogracilibacillus Staphylococcus等微生物的相對(duì)豐度顯著增加 同 時(shí)抑制了Nitrospira Anaeromyxobacter等微生物 的相對(duì)豐度 導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了 顯著變化 A 優(yōu)勢(shì)菌群與耐藥類別的關(guān)系 B 優(yōu)勢(shì)菌群與細(xì)菌群落功能的關(guān)系 C 優(yōu)勢(shì)菌群與細(xì)菌群落代謝的關(guān)系 A Relationship between dominant microflora and drug resistance classes B Relationship between dominant flora and bacterial community function C Relationship between dominant microflora and bacterial community metabolism 圖4 不同處理下土壤優(yōu)勢(shì)菌群與耐藥類別 細(xì)菌群落功能和代謝的關(guān)系 Fig 4 Relationship between dominant microbial community and antimicrobial resistance category bacterial community function and bacterial community metabolism under different treatments 235 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào) 中英文 27 卷 3 3 優(yōu)勢(shì)菌群對(duì)葡萄土壤ARGs及整體功能代 謝的影響 糞肥作為有機(jī)肥已成為土壤中抗生素殘留 物 抗生素耐藥細(xì)菌和ARGs的儲(chǔ)存庫(kù) 研究表 明 連續(xù)施用有機(jī)肥能顯著改變土壤中ARGs和 細(xì)菌群落的相對(duì)豐度 多樣性和組成 49 50 Chen 等 10 發(fā)現(xiàn) 施用有機(jī)糞肥可使其中的抗生素耐藥 細(xì)菌及移動(dòng)遺傳元件在土壤中發(fā)生水平基因轉(zhuǎn) 移 顯著增加土壤中ARGs的多樣性和相對(duì)豐度 并改變與ARGs分布顯著相關(guān)的細(xì)菌群落組成 許多高豐度微生物群落已被證明是土壤ARGs的 載體 11 Wang等 51 研究表明 Proteobacteria和 Actinobacteriota是ARGs的主要潛在宿主 且與 ARGs豐度呈正相關(guān) 在長(zhǎng)期施肥條件下 葡萄 土壤中的耐藥基因數(shù)量和相對(duì)豐度也發(fā)生了顯著 變化 研究顯示 長(zhǎng)期施肥顯著增加了四環(huán)素類 耐藥基因的相對(duì)豐度 52 對(duì)連續(xù)5年施肥的水稻 土壤進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn) ARGs的相對(duì)豐度較CK處理 提高21 9 23 2 53 長(zhǎng)期施肥引起的環(huán)境變化 是導(dǎo)致土壤ARGs變化的關(guān)鍵因素 54 Xiao等 55 研究表明 ARGs與土壤pH呈負(fù)相關(guān) 而Li等 56 的 研究結(jié)果與之相反 本研究表明 長(zhǎng)期施肥后的 葡萄土壤pH下降 多數(shù)ARGs的相對(duì)豐度低于 CK 也有少數(shù)ARGs的相對(duì)豐度高于CK 這進(jìn)一 步證明 土壤pH是影響ARGs豐度的關(guān)鍵因素 土壤pH的變化強(qiáng)烈影響ARGs在土壤中的吸附 和解吸行為 而ARGs存在于土壤微生物中 pH通 過(guò)影響土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能 從而間接 影響ARGs的累積和遷移 56null58 macB在抗生素外 排過(guò)程中發(fā)揮重要作用 其編碼蛋白能將抗生素 從細(xì)胞內(nèi)泵出 降低細(xì)胞內(nèi)抗生素水平 從而增強(qiáng) 細(xì)菌耐藥性 59 Wang等 51 對(duì)豬場(chǎng)附近的土壤調(diào) 查發(fā)現(xiàn) 外排泵是主要的耐藥機(jī)制 本研究也表 明 在葡萄土壤和CK土壤中 macB基因的相對(duì)豐 度最高 宏基因組學(xué)分析表明 多藥耐藥類 大環(huán) 內(nèi)酯類 四環(huán)素類和糖肽類在葡萄土壤和CK中 普遍存在 這表明ARGs廣泛存在于土壤 且難 以完全消除 60 Liu等 61 研究長(zhǎng)期施肥對(duì)紅土 潮 土和黑土ARGs的影響發(fā)現(xiàn) 在這些典型的農(nóng)業(yè) 土壤中 多藥耐藥類是ARGs的主要類型 這與本 研究結(jié)果一致 此外 在長(zhǎng)期施肥模式下 大環(huán)內(nèi) 酯類的耐藥基因出現(xiàn)了生態(tài)適應(yīng)性 對(duì)施肥土壤 環(huán)境表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐受性 這也是葡萄土壤中大 環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因相對(duì)豐度高于CK的重要 原因 62 研究菌屬與耐藥基因類別之間的關(guān)系對(duì)于研 究土壤微生物群落和ARGs的關(guān)系至關(guān)重要 本 研究發(fā)現(xiàn) 不同菌屬對(duì)耐藥基因類別的貢獻(xiàn)率存 在顯著差異 表明微生物群落結(jié)構(gòu)的演替在葡萄 土壤ARGs的豐度變化中起重要作用 這是由于 微生物細(xì)胞內(nèi)存在大量的基因組和質(zhì)粒 這些遺 傳物質(zhì)能夠攜帶ARGs 并在不同微生物之間傳 播 63 抗生素耐藥機(jī)制受蛋白質(zhì)調(diào)控 大環(huán)內(nèi)酯 類耐藥基因就是通過(guò)紅霉素核糖體甲基化 erythromycin ribosome methylation Erm 蛋白的作 用實(shí)現(xiàn)的 這些蛋白能夠甲基化細(xì)菌核