江蘇葫蘆科作物上瓜類褪綠黃化病毒的發(fā)生及其分離物全基因組序列分析.pdf

楊 柳 任春梅 陸 芳 等 江蘇葫蘆科作物上瓜類褪綠黃化病毒的發(fā)生及其分離物全基因組序列分析 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 江蘇葫蘆科作物上瓜類褪綠黃化病毒的發(fā)生 及其分離物全基因組序列分析 楊 柳 任春梅 陸 芳 繆 倩 程兆榜 季英華 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 江蘇南京 摘要 為了分析瓜類褪綠黃化病毒 在江蘇省葫蘆科作物上的分布情況 發(fā)生 趨勢(shì)以及變異情況 本研究對(duì)疑似感染 的葫蘆科樣本進(jìn)行采集 覆蓋了江蘇省 個(gè)地區(qū)的 種常見(jiàn)葫蘆科作 物 通過(guò) 方法對(duì)病樣進(jìn)行了分子鑒定 并對(duì)在泰州采集的黃瓜分離物 進(jìn)行分段克隆與測(cè)序 拼接獲得 的全基因組序列后對(duì)其進(jìn)行了序列比對(duì)和進(jìn)化分析 檢測(cè)結(jié)果顯示 在建湖采集的西葫蘆樣本 泰州 興化和南京江寧地區(qū)采集的黃瓜樣本均有 感染 序列拼接與比對(duì)結(jié)果顯示 分離物 的 序 列與目前已經(jīng)公布的各個(gè)分離物基因組序列相似度在 以上 在進(jìn)化樹(shù)上與山東西葫蘆分離物聚為一支 其 序列與各分離株的相似性為 以上 在進(jìn)化上與廣東分離物聚為一支 本研究結(jié)果表明 可能由 多個(gè)途徑傳入江蘇 并已經(jīng)擴(kuò)大蔓延到江蘇省多個(gè)地區(qū)和多種寄主上 對(duì)該病毒的監(jiān)測(cè)防控已逐漸擴(kuò)大為葫蘆科作物 生產(chǎn)中亟待解決的突出問(wèn)題之一 關(guān)鍵詞 瓜類褪綠黃化病毒 分布 分子鑒定 基因組 系統(tǒng)進(jìn)化分析 中圖分類號(hào) 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 文章編號(hào) 收稿日期 基金項(xiàng)目 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃 編號(hào) 江蘇省農(nóng)業(yè) 科技自主創(chuàng)新資金 編號(hào) 作者簡(jiǎn)介 楊 柳 女 江蘇徐州人 博士 助理研究員 主要 從事蔬菜作物病毒病研究 通信作者 季英華 研究員 主要從事蔬菜病毒病研究 瓜類褪綠黃化病毒 屬于長(zhǎng)形病毒科 毛形 病毒屬 它最早于 年在日本甜瓜 上被發(fā)現(xiàn) 隨后在許多國(guó)家都有報(bào)道 包括蘇丹 黎巴嫩 伊朗 希臘 土耳其 沙特阿拉伯 塞浦路 斯 以色列 美國(guó) 阿爾及利亞 西班牙 韓國(guó)和印度 等 年 于我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)首次被發(fā) 現(xiàn) 而后在山東 北京 上海 河南 湖南 廣西 乃 至海南 新疆和貴州等省份逐漸被報(bào)道 并且其危 害地區(qū)還在不斷擴(kuò)大 是煙粉虱以半持久方式進(jìn)行傳播的 在 自然情況下主要感染葫蘆科作物 目前已經(jīng)報(bào)道的 以甜瓜 西瓜 黃瓜 南瓜 西葫蘆等常見(jiàn)作物居多 但室內(nèi)試驗(yàn)顯示該病毒能夠侵染 種葫蘆科作 物 此外 還可以侵染本氏煙 甜菜 紫花 苜蓿 曼陀羅等植物 等明確了 種雜草 為 的寄主 莊新建等報(bào)道 可以感染 藥用作物地黃 韋建明等報(bào)道 可以感染山 藥 這些結(jié)果表明 的寄主范圍也在不斷 擴(kuò)大 被 感染的植株在早期會(huì)出現(xiàn)中部或基部 葉片的褪綠黃化 而后逐步向上發(fā)展逐漸蔓延至植 株頂部 葉片最初呈現(xiàn)褪綠癥狀 隨著病情發(fā)展 葉 片黃化 同時(shí)仍能看見(jiàn)保持綠色的葉脈等局部組 織 最后導(dǎo)致整個(gè)植株黃化 在大田生產(chǎn)中嚴(yán)重影 響了葫蘆科作物的產(chǎn)量和產(chǎn)品品質(zhì) 已逐漸擴(kuò)大為 葫蘆科作物生產(chǎn)中亟待解決的突出問(wèn)題之一 的基因組由 條正單鏈 和 組成 其中 約 可編碼甲基磷 酸轉(zhuǎn)移酶 依賴 的病毒解旋酶 依賴 的 聚合酶 蛋白和 蛋白 約 可編碼外殼蛋白 小外殼蛋白 類熱 激蛋白 蛋白 蛋白 蛋白 蛋白和 蛋白 在病毒的侵染 復(fù)制和傳播過(guò)程中 這 些蛋白都發(fā)揮了重要的功能 江蘇地區(qū)的設(shè)施蔬菜和露地蔬菜在我國(guó)蔬菜 生產(chǎn)中均占有重要地位 但病毒病的發(fā)生也一直威 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 年第 卷第 期 脅著省內(nèi)蔬菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展 根據(jù)目前已有報(bào)道 在 我國(guó)許多葫蘆科作物種植區(qū)都出現(xiàn)了 的感 染 但在江蘇地區(qū)尚未有針對(duì)性的報(bào)道 筆者所在課 題組于 年在江蘇省內(nèi)針對(duì)葫蘆科作物 感 染進(jìn)行了普查 并對(duì)在主要感染區(qū) 泰州興化 采集 的 分離物進(jìn)行了全基因組序列分析 材料與方法 病原材料 年 月在江蘇省多個(gè)葫蘆科作物生 產(chǎn)地采集到各種葫蘆科作物疑似病毒病感染樣品 主要為植株葉片 少部分為果實(shí) 癥狀表現(xiàn)為斑駁 褪綠 黃化 皺縮 畸形等 需要保存的樣品經(jīng)液氮 速凍存于 冰箱 提取和 的合成 取 病葉樣品 如果是病果則切取果皮部 分 于液氮中充分研磨成粉末 使用多糖多酚植物 試劑盒 上海浦迪生物科技有限公司 按說(shuō)明 書步驟操作提取 而后取 使用 試劑盒 南京諾唯贊生物 科技股份有限公司 按說(shuō)明書步驟反轉(zhuǎn)錄成 用于 和克隆 檢測(cè)分析 采用引物 和 對(duì)反轉(zhuǎn)錄后的病樣 進(jìn)行 擴(kuò)增 擴(kuò)增體系為 南京諾唯贊生物科技股份有限公司 前后引物各 模板 補(bǔ)足 至 反應(yīng)程序 預(yù)變性 變性 退火 延伸 個(gè)循環(huán)后 再 延伸 若電泳后在約 處出現(xiàn) 目的條帶則將 產(chǎn)物送至南京擎科生物科技有 限公司進(jìn)行序列測(cè)定 基因組序列克隆與測(cè)序 根據(jù)干射香等設(shè)計(jì)的引物 分段擴(kuò)增并通過(guò) 拼接獲得 和 序列全長(zhǎng) 擴(kuò)增體系 南京諾唯贊生物科技股份有限 公司 前后引物各 模板 補(bǔ)至 反應(yīng)程序 預(yù)變性 變性 退火 延伸 個(gè)循環(huán) 延伸 產(chǎn)物經(jīng) 的瓊 脂糖凝膠電泳后 在紫外燈下切取凝膠上的目的條 帶 使用 膠回收試劑盒 愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有 限公司 根據(jù)說(shuō)明書步驟進(jìn)行回收 回收產(chǎn)物連接 至 載體 北京全式金生物技術(shù)有限 公司 轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 南京擎科 生物科技有限公司 挑取單克隆經(jīng) 篩選后送 至南京擎科生物科技有限公司測(cè)序 序列比對(duì)分析 將測(cè)序測(cè)得的所有序列利用 軟件里 的 功能進(jìn)行拼接獲得 和 全長(zhǎng)序列 比對(duì)分析使用 網(wǎng)站的 和 軟件 聚類分析和進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建使用 軟件 結(jié)果與分析 江蘇省 的發(fā)生情況 本研究于 年在江蘇省內(nèi)共采集樣本 份 分別來(lái)自于 個(gè)地區(qū)的 種常見(jiàn)葫蘆科作物 表 寄主植物樣品大多數(shù)來(lái)源于種植面積較大的葫 蘆科作物 如西瓜 甜瓜 南瓜和黃瓜 對(duì)所采樣品 提取 經(jīng)過(guò) 檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)在建湖 興 化 南京采集的樣品中均檢測(cè)出了 其他地區(qū) 樣品中均未檢出 圖 在南京江寧采集的 份 甜瓜中有 份檢出 份黃瓜樣品中有 份 檢出 總檢出率為 在興化采集的 份樣 品中黃瓜占 份 絲瓜 份 其中包括絲瓜在內(nèi)的 份樣品檢出 檢出率為 在建湖采 集的 份西葫蘆樣品中全部檢出 在全部 份樣品中 總檢出率為 表 樣品采集地點(diǎn)和種類統(tǒng)計(jì) 采樣地 樣品 份 黃瓜西瓜甜瓜絲瓜西葫蘆南瓜葫蘆本地合計(jì) 建湖 興化 海門 南京 泗洪 盱眙 姜堰 大豐 各地合計(jì) 泰州興化分離物基因組特征分析 采用分段克隆拼接的策略 對(duì) 泰州興化 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 年第 卷第 期 黃瓜分離物 的每條鏈分別分 段進(jìn) 行克隆 通過(guò)軟件拼接獲得 全基因組 序列 對(duì) 序列信息進(jìn)行分析比對(duì)發(fā) 現(xiàn) 該分離物的 序列全長(zhǎng)共計(jì) 個(gè)堿基 包含 個(gè)開(kāi)放閱讀框 其中 位堿 基為 編碼 個(gè)由 個(gè)氨基酸組成 分子 量約 的蛋白 位堿基為 編碼 個(gè)由 個(gè)氨基酸組成 分子量約 的蛋白 位堿基編碼 個(gè)由 個(gè)氨基酸組成 分子量約 的蛋白 位堿基編碼 個(gè)由 個(gè)氨基酸組成 分子量 約 的蛋白 和 的長(zhǎng)度分 別為 和 序列全長(zhǎng)共計(jì) 個(gè)堿基 編碼 個(gè)蛋 白 其中 位堿基編碼由 個(gè)氨基酸組 成 分子量約 的蛋白 位 堿基編碼由 個(gè)氨基酸組成 分子量約 的蛋白 位堿基編碼 個(gè)由 個(gè)氨基酸組成 分子量約 的蛋白 位堿基編碼由 個(gè)氨基酸組成 分子量約 的蛋白 位堿基編碼由 個(gè)氨基酸組成 分子量約 的蛋白 位堿基編碼由 個(gè)氨基酸組成 分子量約 的蛋白 位堿基編碼由 個(gè)氨基酸組成 分子量約 的蛋白 位堿基編碼由 個(gè)氨基酸組成 分 子量約 的蛋白 和 的長(zhǎng) 度分別為 和 分析結(jié)果表明 的 序列與目前已經(jīng)公布的各個(gè)分離物基因組序列的 相似度在 以上 其中與北京分離物 和河南分離物 的相似度最高 序列一致性達(dá) 但 的 各編碼基因和非編碼序列與已知 分離物的各 序列相似度不完全一致 其中 和 基因序列保守性較高 大多數(shù)分離物的相似性為 堿基變化較多存在于 和 基因上 它們的一致性在 之間 表 的 序列與目前已公布的分 離物基因組序列相似度在 以上 其中與廣 東分離物 相似度最高 序列一致 性達(dá) 的各編碼基因 和非編碼序列與已知 分離物的各序列相似度 也不完全一致 其中 和 序列保 守性較高 許多分離物的相似性高達(dá) 而 和 上的變異較多 其一致性在 之間 表 將本研究獲得的分離物 與已經(jīng) 公布的和其一致性較高的 個(gè)分離物 的序列進(jìn)行比較分析 結(jié)果 表 顯示 這 個(gè)分離物中共有 個(gè)位點(diǎn)存在堿 基變化 中有 個(gè)差異堿基位點(diǎn) 中有 個(gè) 與其他 個(gè)分離物均不相同的位點(diǎn)有 個(gè) 中 個(gè) 中 個(gè) 上的差 異堿基位點(diǎn)共有 個(gè)為同義突變 個(gè)位點(diǎn)為錯(cuò)義 突變 上有 個(gè)位點(diǎn)為同義突變 個(gè)錯(cuò)義突 變 另外還有 個(gè)突變位點(diǎn)處于 的 區(qū) 域 錯(cuò)義突變存在的位置分別位于 和 上 將 中有全基因組序列報(bào)道的 和 序列分別使用鄰接法 進(jìn)行聚類分析 將毛形病毒屬成員萵苣 褪綠病毒 作為外群 進(jìn)化樹(shù)分支 置信度 使用 次自導(dǎo)復(fù)制驗(yàn)證 由 此構(gòu)建的 結(jié)果 圖 顯示 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 年第 卷第 期 表 分離物與 中其他分離物 的序列相似性 登錄號(hào)分離物宿主地區(qū) 相似性 基因組 黃瓜中國(guó)北京 哈密瓜美國(guó)喬治亞州 西葫蘆中國(guó)山東 地黃中國(guó)河南 黃瓜美國(guó)喬治亞州 黃瓜中國(guó)廣東 黃瓜中國(guó)廣東 黃瓜中國(guó)廣東 野蘿卜美國(guó)喬治亞州 甜瓜中國(guó)河南 西瓜以色列 中國(guó)河南 黃瓜中國(guó)山東 甜瓜中國(guó)上海 甜瓜中國(guó)臺(tái)灣 甜瓜中國(guó)新疆 甜瓜日本熊本 注 表示沒(méi)有相應(yīng)信息 表 分離物與 中其他分離物 的序列相似性 序列號(hào)分離物 相似性 基因組 注 表示沒(méi)有相應(yīng)信息 與其他 分離物聚在一起 表明 該分離物確實(shí)為 成員之一 根據(jù) 序列 的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析可以看出 與山東分離物 聚為一支 圖 說(shuō)明 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 年第 卷第 期 表 種 分離物序列突變位點(diǎn)比較分析 片段 堿基 位點(diǎn) 基因 或 氨基酸 替換 表 續(xù) 片段 堿基 位點(diǎn) 基因 或 氨基酸 替換 注 表示該位點(diǎn)突變的堿基由于位于非編碼區(qū)域 因此不涉及氨基酸 變化 表示同義突變 它們之間 親緣關(guān)系較近 但從 序列的 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可以看出 與廣 東分離物 聚為一支 圖 表明這 個(gè)分 離物的 親緣關(guān)系較近 討論與結(jié)論 最初在 年被發(fā)現(xiàn) 后來(lái)在世界許多 國(guó)家的葫蘆科作物上均有發(fā)生報(bào)道 近些年來(lái)出現(xiàn) 越來(lái)越多的報(bào)道 年該病毒在我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)被 發(fā)現(xiàn) 而后在多個(gè)省市陸續(xù)被發(fā)現(xiàn) 劉放等調(diào)查發(fā) 現(xiàn)湖南省南瓜 檢出率呈上升趨勢(shì) 并且對(duì) 分離物的 基因進(jìn)行選擇壓力和中性檢測(cè) 分析 結(jié)果顯示 我國(guó)種群受到正向選擇壓力或多 樣化選擇作用 其種群多態(tài)性較低 正處于擴(kuò)張趨 勢(shì) 但從世界范圍來(lái)看 維持相對(duì)穩(wěn)定狀 態(tài) 本研究團(tuán)隊(duì)在前期研究普查中 曾于 年在山東壽光的黃瓜上發(fā)現(xiàn) 感染 后于 年在江蘇 個(gè)地區(qū)的 種葫蘆科作物 調(diào)查中發(fā)現(xiàn)豐縣 睢寧 南京 蘇州采集的樣品中出 現(xiàn)該病毒 感染寄主有黃瓜 西瓜和甜瓜 總感染率 為 這是首次在江蘇省境內(nèi)發(fā)現(xiàn) 的 侵染 年在對(duì)南京市 泰州市姜堰區(qū)和另外 個(gè)地區(qū)進(jìn)行葫蘆科作物調(diào)研的過(guò)程中 又發(fā)現(xiàn)了該 病毒的侵染 除了黃瓜和甜瓜外 絲瓜和西葫蘆也 檢出 本次樣品 總檢出率為 該病毒在江蘇省內(nèi)的傳播可能也呈現(xiàn)逐漸擴(kuò)大的 趨勢(shì) 煙粉虱的流行暴發(fā)本身就會(huì)給蔬菜產(chǎn)業(yè)造成 損失 而且煙粉虱又可以同時(shí)攜帶多種病毒 再加 上它們食性繁雜 寄主廣泛 這就給相關(guān)病毒的擴(kuò) 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 年第 卷第 期 展蔓延提供了很多機(jī)會(huì) 走訪調(diào)查發(fā)現(xiàn)該病毒 病的暴發(fā)時(shí)間與煙粉虱的暴發(fā)時(shí)間相吻合 條件適 宜的溫室環(huán)境下隨時(shí)可能暴發(fā) 而露地作物在 月期間也有可能集中暴發(fā) 不僅煙粉虱向周邊 地區(qū)的擴(kuò)散會(huì)造成病毒的蔓延 蔬菜作物和種子的 貿(mào)易往來(lái)等也會(huì)造成病毒長(zhǎng)距離的傳播 圖 為分別基于 中不同 分離物的 和 全序列分析構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) 該類型的進(jìn) 化樹(shù)是很多次 得到的平均結(jié)果 從圖 可以看出 無(wú)論是 還是 來(lái)自國(guó)外的分 離物 美國(guó)分離物 日本分離物和以色列分離物 都 聚在一個(gè)大分支上 這說(shuō)明 的進(jìn)化具有一定 的地域性 在國(guó)內(nèi)分離物中 江蘇分離物 的 與山東分離物 親緣關(guān)系最近 但是 其 卻與廣東分離物 親緣關(guān)系最近 這 可能意味著該病毒通過(guò)多種途徑傳入江蘇 并在不 同毒株之間發(fā)生了復(fù)制重組 實(shí)驗(yàn)室條件下發(fā)現(xiàn)該病毒能感染 種葫蘆科 作物 本研究在葫蘆科作物集中生產(chǎn)地采集的黃 瓜 甜瓜 絲瓜和西葫蘆上均發(fā)現(xiàn)了該病毒 這說(shuō)明 該病毒在自然狀態(tài)下確實(shí)可以感染多種作物導(dǎo)致 生產(chǎn)問(wèn)題 目前已有報(bào)道該病毒在自然情況下侵 染西甜瓜 西葫蘆 黃瓜等多種葫蘆科作物 其中 感染絲瓜還未有詳細(xì)報(bào)道 因此該病毒是葫 蘆科作物生產(chǎn)中的巨大威脅 還有研究報(bào)道其能 感染 種雜草 這更加大了該病毒的防控難度 在 生產(chǎn)中不僅要注意作物本身的防控還要注意田邊 雜草的管理 此外 相似度和系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)來(lái) 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 年第 卷第 期 源于同一寄主的分離物并沒(méi)有聚在一起 圖 表 明該病毒的進(jìn)化不受寄主的影響 參考文獻(xiàn) 孫曉輝 趙 靜 代惠潔 等 瓜類褪綠黃化病毒在山東省的流 行調(diào)查及西葫蘆分離物全基因組擴(kuò)增與序列分析 植物病 理學(xué)報(bào) 臧連毅 孫曉輝 蘇文敏 等 瓜類褪綠黃化病毒山東分離物全 基因組序列擴(kuò)增及分析 植物保護(hù)學(xué)報(bào) 劉珊珊 彭 斌 吳會(huì)杰 等 海南省和河南省發(fā)生甜瓜褪綠黃 化病的分子鑒定 果樹(shù)學(xué)報(bào) 唐 鑫 張德詠 李 凡 等 瓜類褪綠黃化病毒 在湖南省的首次報(bào)道及其流行動(dòng)態(tài)研究 植物病理學(xué)報(bào) 劉 放 劉 勇 張德詠 等 瓜類褪綠黃化病毒自然侵染南瓜 及分子進(jìn)化分析 植物病理學(xué)報(bào) 楊世安 李戰(zhàn)彪 秦碧霞 等 廣西三種甜瓜病毒分離物的分子 檢測(cè)與鑒定 植物保護(hù) 彭 斌 劉莉銘 劉珊珊 等 瓜類褪綠黃化病毒新疆分離物基 因組分析 植物病理學(xué)報(bào) 潘衛(wèi)萍 張以和 吉艷玲 吐魯番首次發(fā)生甜瓜褪綠黃化病毒病 蔬菜 韋建明 岳寧波 李云洲 貴州首次報(bào)道瓜類褪綠黃化病毒侵染 山藥 植物病理學(xué)報(bào) 莊新建 郭 梟 丁詩(shī)文 等 河南溫縣地黃上瓜類褪綠黃化病 毒的鑒定及其 序列分析 植物病理學(xué)報(bào) 古勤生 彭 斌 劉珊珊 等 瓜類新病毒病害 一 瓜類褪綠 黃化病 中國(guó)瓜菜 干射香 山東黃瓜分離物基因組結(jié)構(gòu)特征及致病相關(guān)蛋 白研究 荊州 長(zhǎng)江大學(xué) 干射香 涂麗琴 吳淑華 等 山東壽光黃瓜上瓜類褪綠黃化病 毒的分子鑒定 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) 楊 柳 況佳穎 任春梅 等 江蘇省主要葫蘆科作物病毒種類 及分布 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 年第 卷第 期