避雨栽培對(duì) 赤霞珠 葡萄果表微生物多樣性的影響.pdf

園藝學(xué)報(bào) 2023 50 3 635 646 Acta Horticulturae Sinica doi 10 16420 j issn 0513 353x 2021 1190 http www ahs ac cn 635 收稿日期 2022 11 26 修回日期 2023 01 04 基金項(xiàng)目 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目 2019YFD1002500 寧夏回族自治區(qū)重大研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目 2020BCF01003 國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù) 體系建設(shè)專項(xiàng)資金項(xiàng)目 CARS 29 通信作者 Author for correspondence E mail yuyangsong 避雨栽培對(duì) 赤霞珠 葡萄果表微生物多樣性的 影響 黃 蓉 1 董 超 1 姜 嬌 1 秦 義 1 2 劉延琳 1 2 宋育陽(yáng) 1 2 1 西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院 陜西楊凌 712100 2 西北農(nóng)林科技大學(xué)寧夏賀蘭山東麓葡萄酒試驗(yàn)示范站 寧夏 永寧 750104 摘 要 以避雨栽培和露天栽培 對(duì)照 釀酒葡萄 赤霞珠 為材料 利用高通量測(cè)序技術(shù) 研究 果實(shí)轉(zhuǎn)色期和成熟期果表微生物的多樣性以及群落結(jié)構(gòu) 兩種模式下果表的主要真菌和細(xì)菌分別是子囊 菌門 Ascomycota 占比 90 以上 和變形菌門 Proteobacteria 避雨栽培減少了炭疽病菌 Colletotrichum 的定殖 降低了誘導(dǎo)果實(shí)腐爛且產(chǎn)生毒素的鏈格孢屬 Alternaria 的豐度 且避雨條 件更適合于固氮細(xì)菌假單胞菌屬 Pseudomonas 和泛菌屬 Pantoea 的生長(zhǎng) 此外 避雨處理中曲霉屬 Aspergillus 和單端孢霉屬 Trichothecium 的豐度普遍高于露天對(duì)照 NMDS 分析與 Welch s t 檢測(cè)表 明 避雨栽培引起了轉(zhuǎn)色期的真菌和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的顯著差異 脅強(qiáng)系數(shù) stress 0 1 且 P 90 and Proteobacteria were the dominant fungal and bacterial phylum in both rain shelter and open field cultivation patterns Compared with grapes being cultivated in the open field rain shelter reduced the richness of Colletotrichum therefore decreasing the risk of developing anthracnose on grape berries In this scenario a decreased abundance of Alternaria which was associated with berry rot and secretion of killer toxins was also seen Additionally rain shelter conditions were more Huang Rong Dong Chao Jiang Jiao Qin Yi Liu Yanlin Song Yuyang Investigation of the effect of rain shelter cultivation on the microbial diversity of berry surface for Cabernet Sauvignon grapes 636 Acta Horticulturae Sinica 2023 50 3 635 646 suitable for the development of Pseudomonas and Pantoea both bacteria are capable of nitrogen fixing The abundance of Aspergillus and Trichothecium were commonly higher in the rain shelter treatment than in the control NMDS analysis with Welch s t test suggested that rain shelter resulted in significant differences in fungal and bacterial community structure at the veraison stage stress 0 1 P 0 05 In summary rain shelter enhanced the colonization of microbes that are beneficial to vine growth and grape quality whilst also reducing the richness of microorganisms that could potentially cause diseases affecting grape health Keywords wine grape rain shelter cultivation microbial community diversity analysis high throughput sequencing analysis 葡萄果實(shí)表面定殖的微生物對(duì)果實(shí)生長(zhǎng)和釀酒品質(zhì)有影響 Nisiotou et al 2011 Gao et al 2019 葡萄表面附著的寄生霉菌有些能夠引起相應(yīng)病害 例如葡萄霜霉病菌 Plamospara viticola 引起霜霉病 葡萄白粉菌 Erysiphe necator 導(dǎo)致白粉病 Barata et al 2012 灰葡萄孢菌 Botrytis cinerea 可致葡萄裂果 曲霉屬 Aspergillus 枝孢屬 Cladosporium 和青霉屬 Penicillium 均 可導(dǎo)致葡萄枯萎 皺縮 藤蔓腐爛和組織損傷 Barata et al 2012 葡萄表面的霉菌不僅能引起果 實(shí)破損 其分泌的代謝物還會(huì)間接影響葡萄酒發(fā)酵菌群的存活狀態(tài) 進(jìn)而影響葡萄酒的發(fā)酵進(jìn)程 Ciani et al 2010 Barata et al 2012 Morrison Whittle Goddard 2018 酵母菌和其他真菌的代謝過程對(duì)葡萄酒的風(fēng)味具有顯著影響 隱球酵母屬 Cryptococcus 有 孢漢遜酵母屬 Hanseniaspora 紅酵母屬 Rhodotorula 和曲霉屬 Aspergillus 有助于促進(jìn)風(fēng)味 物質(zhì)的形成和塑造獨(dú)特的感官特性 Hong Park 2013 葡萄汁中的細(xì)菌種群以芽孢桿菌屬 Bacillus 腸球菌屬 Enterobacteriales 和假單胞菌屬 Pseudomonas 為主 其代謝產(chǎn)物也可影 響葡萄酒的化學(xué)組成 Bokulich et al 2014 Portillo Mas 2016 在葡萄成熟期 隨著漿果表面 積增大 糖分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的可利用性增加 果表的弱發(fā)酵型酵母和乳酸菌逐漸增多 Bokulich et al 2014 Morrison Whittle Goddard 2018 主要包括孢漢遜酵母屬 Hanseniaspora 假絲酵母屬 Candida 梅奇酵母屬 Metschnikowia 酒球菌屬 Oenoccocus 和乳桿菌屬 Lactobacillus 等 這些微生物從果實(shí)表面轉(zhuǎn)移進(jìn)葡萄汁中 能夠適應(yīng)苛刻的發(fā)酵環(huán)境并迅速繁殖 具有改變葡萄 酒風(fēng)味 香氣和質(zhì)量的巨大潛力 Grangeteau et al 2017 Mezzasalma et al 2017 中國(guó)釀酒葡萄產(chǎn)區(qū) 尤其是陜西 河北和廣西等地受季風(fēng)影響 夏季雨熱同期 在葡萄轉(zhuǎn)色和 成熟收獲階段面臨強(qiáng)降雨的影響 一些病害微生物豐度升高 導(dǎo)致果實(shí)腐爛和產(chǎn)量下降 Yu et al 2017 避雨栽培可以起保護(hù)作用 Chen et al 2020 轉(zhuǎn)色期是葡萄生長(zhǎng)過程的一個(gè)關(guān)鍵時(shí)期 在 這個(gè)時(shí)期果實(shí)中單寧和芳香類物質(zhì)開始升高 可溶性物質(zhì)開始積累 Kalua Boss 2009 Zhang et al 2016 葡萄果實(shí)在成熟期進(jìn)一步膨大 是活性物質(zhì) 酚類化合物 和風(fēng)味物質(zhì) 萜烯類化合物 積累最旺盛的時(shí)期 Kalua Boss 2009 轉(zhuǎn)色期和成熟期降雨量過多 會(huì)稀釋果實(shí)的風(fēng)味物質(zhì) 增加果實(shí)感病幾率 導(dǎo)致果實(shí)皺縮甚至腐爛 使品質(zhì)和產(chǎn)量下降 Barata et al 2012 Yu et al 2017 栽培模式與葡萄果實(shí)微生物群之間的關(guān)系研究甚少 因此 在陜西葡萄酒產(chǎn)區(qū) 采用高通量測(cè) 序的技術(shù) 研究避雨栽培對(duì)廣泛種植的釀酒葡萄 赤霞珠 在轉(zhuǎn)色期和成熟期兩個(gè)關(guān)鍵時(shí)期的果表 微生物多樣性以及群落結(jié)構(gòu)的影響 為避雨栽培的可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù) 黃 蓉 董 超 姜 嬌 秦 義 劉延琳 宋育陽(yáng) 避雨栽培對(duì) 赤霞珠 葡萄果表微生物多樣性的影響 園藝學(xué)報(bào) 2023 50 3 635 646 637 1 材料與方法 1 1 試驗(yàn)材料與避雨處理 試驗(yàn)于 2020 年 7 9 月在陜西涇陽(yáng)日新農(nóng)業(yè)園進(jìn)行 該園地處溫帶大陸性季風(fēng)氣候區(qū) 材料為 7 年生釀酒葡萄 赤霞珠 株距 1 2 m 行距 1 5 m 單干雙臂型整形 長(zhǎng)短枝修剪 株高 1 5 m 避雨棚搭建在 6 行植株上方 到地面的垂直距離為 2 5 m 棚下 90 株 以露天栽培為對(duì)照 其他管 理方式一致 避雨與露天栽培兩個(gè)處理相距 3 m 1 2 取樣設(shè)計(jì)與樣品采集 采用 五點(diǎn)取樣法 Zhang et al 2017 分別采收避雨栽培與露天栽培下的轉(zhuǎn)色期和成熟期的 果實(shí) 用 75 酒精消毒后的鑷子夾取滅菌棉花 蘸 0 9 NaCl 溶液 擦拭整個(gè)果實(shí) 無病害 表面 10 s 每個(gè)果實(shí)擦拭 5 次 將棉花收集到滅菌的 5 mL 離心管中作為 1 個(gè)樣本 樣本用液氮速凍后放 置 80 冰箱備用 設(shè) 6 次生物學(xué)重復(fù) 每個(gè)重復(fù)由 5 串果實(shí)的果表微生物組成 1 3 DNA 提取及 PCR 擴(kuò)增 果表微生物的 DNA 提取使用 HiPure Soil DNA 提取試劑盒 Magen Guangzhou China 按 照操作指南進(jìn)行 16S rRNA 細(xì)菌 基因擴(kuò)增引物為 341F 5 CCTACGGGNGGCWGCAG 3 和 806R 5 GGACTACHVGGGTATCTAAT 3 Huang et al 2021 ITS2 rDNA 真菌 序列擴(kuò)增引物為 ITS3 KYO2 5 GATGAAG AACGYAGYRAA 3 和 ITS4 5 TCCTCCGCTTATTGATATGC 3 Ali et al 2019 PCR 擴(kuò)增 94 2 min 然后 98 10 s 62 30 s 68 30 s 進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán) 最后 68 延伸 5 min 擴(kuò)增體系 20 L 5 L 10 KOD 緩沖液 5 L 2 mmol L 1 dNTPs 3 L 25 mmol L 1 MgSO 4 上 下游引物各 1 5 L 10 mol L 1 1 L KOD 聚合酶 100 ng 模板 DNA 3 L 樣品 的 PCR 產(chǎn)物送至廣州基迪奧測(cè)序公司測(cè)序 1 4 細(xì)菌和真菌物種組成分析 用 FASTP 版本 0 18 0 對(duì) Illumina 平臺(tái)的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾 過濾標(biāo)準(zhǔn) 1 去除含有未知核 苷酸 N 10 的 reads 2 去除 phred 質(zhì)量評(píng)分 20 的堿基 50 的 reads 3 刪除含接頭的 reads 過濾后獲得的 clean reads 用于組裝分析 使用 UPARSE 版本 9 2 64 Edgar 2013 流程將 clean tag 根據(jù) 97 相似度聚類為 OTU operational taxonomic units 操作分類單元 選取豐度最高 的 tag 序列作為每個(gè) OTU 的代表序列 組間共有和特有 OTU 分別使用 R 語言 VennDiagram 版本 1 6 16 進(jìn)行 Venn 分析 OTU 代表序列比對(duì) SILVA 據(jù)庫(kù) 版本 132 使用 RDP 注釋軟件 版本 2 2 的樸素貝葉斯模型 進(jìn)行物種分類注釋 置信閾值設(shè)為 0 8 1 0 使用 Krona 版本 2 6 顯示每個(gè)物種分類的豐度統(tǒng)計(jì) 數(shù)據(jù) 使用 R 語言 ggplot2 版本 2 2 1 展示物種豐度堆疊圖 用維恩圖來表示樣本間的微生物群 落共有的或者特有的 OUT 數(shù) 直觀展示樣本中 OTU 組成的相似性和特異性 處理間物種豐度差異分析使用 R 語言 Vegan 包 版本 2 5 3 進(jìn)行 Welch s t 檢驗(yàn) 使用 LEfSe linear discriminant analysis effect size 線性判別分析 軟件對(duì)樣本的標(biāo)志性 Biomarker 物種進(jìn) 行篩選 多樣性是指特定生境或者生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的微生物多樣性情況 通常利用物種豐富度與物種均勻 Huang Rong Dong Chao Jiang Jiao Qin Yi Liu Yanlin Song Yuyang Investigation of the effect of rain shelter cultivation on the microbial diversity of berry surface for Cabernet Sauvignon grapes 638 Acta Horticulturae Sinica 2023 50 3 635 646 度來評(píng)估 采用 Sob 和 Chao1 指數(shù)來表征物種豐富程度 Simpson 指數(shù)體現(xiàn)物種的豐富度和均勻度 在 QIIME 版本 1 9 1 Caporaso et al 2010 中計(jì)算 Sob Chao1 Simpson 等 多樣性指數(shù) 樣 本間的 指數(shù)比較使用 R 語言 Vegan 版本 2 5 3 Zhang et al 2017 進(jìn)行 Tukey s HSD 檢驗(yàn) 多樣性指生態(tài)系統(tǒng)間物種多樣性的差異 對(duì)樣本或者分組間菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行的比較 選擇 PCoA 主坐標(biāo) PCoA 分析 principal coordinates analysis 和 NMDS 非度量多維標(biāo)度 non metric multi dimensional scaling 分析展示樣本間菌群結(jié)構(gòu)的差異程度 檢驗(yàn) NMDS 模型分析結(jié)果的優(yōu)劣 用脅強(qiáng)系數(shù) stress 來衡量 通常認(rèn)為 stress 0 1 時(shí) 模型成立 當(dāng) stress 0 05 時(shí) 模型則具有 很好的代表性 用 R 語言 Vegan 版本 2 5 3 Zhang et al 2017 進(jìn)行基于 bray curtis 距離的 PCoA 和 NMDS 分析來衡量微生物群落結(jié)構(gòu)的 多樣性 2 結(jié)果與分析 2 1 果實(shí)表面微生物群落的組成 2 1 1 真菌 避雨棚和露天栽培的 赤霞珠 葡萄轉(zhuǎn)色期和成熟期果表主要的真菌菌門有 10 種 圖 1 a 子囊菌門 Ascomycota 是優(yōu)勢(shì)的真菌門 在各樣品中的占比達(dá)到 90 以上 擔(dān)子菌門 Basidiomycota 在露天轉(zhuǎn)色期樣本中占比最高 7 47 在避雨棚轉(zhuǎn)色期樣本中占比最低 1 24 花藻門 Anthophyta 隨著果實(shí)成熟其豐度降低 在避雨棚轉(zhuǎn)色期樣本中占比最高 3 27 在露天成熟 期樣本中最低 1 20 其余真菌物種在每個(gè)分組的豐度均低于 1 基于真菌屬分類水平進(jìn)行物種組成分析 球腔圍屬 Mycosphaerella 和枝孢菌屬 Cladosporium 在避雨棚轉(zhuǎn)色期樣本中占比最高 總和為 62 72 圖 1 b 僅在成熟期的露天對(duì)照檢測(cè)到酵母屬 的有孢漢遜酵母屬 Hanseniaspora 6 85 避雨條件下的炭疽菌屬 Colletotrichum 隨著果實(shí)成 熟豐度逐漸降低 而露天對(duì)照豐度上升 曲霉菌屬 Aspergillus 在避雨條件下的豐度普遍高于對(duì) 照 在避雨棚成熟期樣本中占比最高 3 57 單端孢屬 Trichothecium 在避雨棚成熟期樣本中 的占比最高 8 32 在其余組均低于 1 基于 ITS rRNA 基因的真菌測(cè)序 使用 97 的核苷酸序列同一性 發(fā)現(xiàn) 4 個(gè)樣本共有 120 個(gè) 真菌 OTU 圖 2 a 避雨棚轉(zhuǎn)色期真菌 OTU 最多 567 個(gè) 其次是露天轉(zhuǎn)色期 453 個(gè) 再次 是避雨棚成熟期 345 個(gè) 露天成熟期最少 306 個(gè) 避雨棚轉(zhuǎn)色期特有 251 個(gè)真菌 OTU 而露 天對(duì)照轉(zhuǎn)色期特有 137 個(gè) 避雨棚成熟期特有 91 個(gè) 露天對(duì)照成熟期特有 67 個(gè) 2 1 2 細(xì)菌 細(xì)菌群落的多樣性比真菌更復(fù)雜 變形菌門 Proteobacteria 隨果實(shí)成熟豐度急劇上升 在避 雨棚和露天轉(zhuǎn)色期樣本的占比分別為 44 91 和 53 92 在避雨棚和露天成熟期樣本的占比分別為 94 71 和 73 35 厚壁菌門 Firmicutes 在避雨棚轉(zhuǎn)色期樣本中占比最高 15 43 避雨棚成熟 期樣本中占比最低 1 02 成熟期擬桿菌門 Bacteroidetes 豐度降低 在避雨棚和露天成熟期 樣本中占比分別為 1 24 和 2 68 藍(lán)細(xì)菌 Cyanobacteria 豐度隨果實(shí)成熟降低 避雨可以減少 其定殖 在避雨棚轉(zhuǎn)色期樣本中占比最高 9 36 避雨棚成熟期樣本中占比最低 0 45 避雨 栽培下浮霉菌門 Planctomycetes 的豐度低于對(duì)照 在避雨棚成熟期樣本中豐度最低 0 28 圖 1 c 塔特姆菌屬 Tatumella 泛菌屬 Pantoea 和假單胞菌屬 Pseudomonas 是果實(shí)表面細(xì)菌的 黃 蓉 董 超 姜 嬌 秦 義 劉延琳 宋育陽(yáng) 避雨栽培對(duì) 赤霞珠 葡萄果表微生物多樣性的影響 園藝學(xué)報(bào) 2023 50 3 635 646 639 主要屬 塔特姆菌屬 Tatumella 在避雨棚成熟期樣本中占比最高 16 38 露天轉(zhuǎn)色期樣本中 占比最低 0 33 隨著果實(shí)進(jìn)入成熟期 泛菌屬 Pantoea 占比逐漸增多 比對(duì)照組高 2 74 且避雨更利于其生長(zhǎng) 對(duì)于假單胞菌屬 Pseudomonas 避雨更利于其生長(zhǎng) 在避雨棚轉(zhuǎn)色期樣本 中占比最高 14 25 成熟期不動(dòng)桿菌屬 Acinetobacter 豐度上升 避雨比對(duì)照低 3 28 嗜冷 桿菌屬 Psychrobacter 在果實(shí)成熟期并未檢測(cè)出 僅存在于避雨棚和露天轉(zhuǎn)色期樣本中 與對(duì)照 相比 避雨模式可以減少鞘氨醇單胞菌屬 Sphingomonas 和馬賽菌屬 Massilia 的豐度 圖 1 d 圖 1 避雨棚和露天栽培的 赤霞珠 葡萄果實(shí)表面真菌 a b 和細(xì)菌 c d 群落組成 a 和 c 群落門分類水平 b 和 d 群落屬分類水平 S 避雨棚 N 露天栽培 對(duì)照 V 轉(zhuǎn)色期 R 成熟期 下同 Fig 1 Composition of fungal a b and bacterial c d communities on the surface of Cabernet Sauvignon grapes cultivated in rain shelter and open field modes a and c at phylum level b and d at genus level S Rain shelter mode N Open field mode control V Veraison stage R Ripening stage The same below 基于 16S rRNA 基因的細(xì)菌測(cè)序 揭示葡萄果表的細(xì)菌 OTU 組成 圖 2 b 4 個(gè)樣本中共有 的物種有 121 個(gè)細(xì)菌 OTU 避雨棚轉(zhuǎn)色期 露天轉(zhuǎn)色期 避雨棚成熟期和露天成熟期樣本分別含有 1 807 1 005 395 和 696 個(gè) OTU 避雨棚轉(zhuǎn)色期樣本特有 1 167 個(gè)細(xì)菌 OTU 露天轉(zhuǎn)色期樣本特 有 429 個(gè) 避雨棚成熟期樣本特有 69 個(gè) 露天成熟期樣本特有 278 個(gè) 對(duì)比真菌 細(xì)菌的群落組成 更加龐大復(fù)雜 避雨棚轉(zhuǎn)色期樣本中的細(xì)菌 OTU 最多 1 807 個(gè) 在避雨棚成熟期樣本中最少 395 個(gè) Huang Rong Dong Chao Jiang Jiao Qin Yi Liu Yanlin Song Yuyang Investigation of the effect of rain shelter cultivation on the microbial diversity of berry surface for Cabernet Sauvignon grapes 640 Acta Horticulturae Sinica 2023 50 3 635 646 圖 2 避雨棚和露天栽培的 赤霞珠 葡萄果實(shí)表面共有或者特有的真菌 a 和細(xì)菌 b 的 OTU Fig 2 Fungal a and bacterial b OTUs shared or specific on the surface of Cabernet Sauvignon grapes cultivated in rain shelter and open fields 2 2 避雨栽培對(duì)果實(shí)表面微生物群落豐富度和多樣性的影響 2 2 1 真菌 覆蓋率 Good s coverage 反映樣本的測(cè)序飽和度 赤霞珠 避雨棚和露天栽培的轉(zhuǎn)色期和 成熟期 4 個(gè)樣本的真菌測(cè)序覆蓋率均為 1 00 表 1 說明樣本測(cè)序最終拼接組裝獲得的序列足夠覆 蓋真菌物種所有的區(qū)域 Sobs Chao1 指數(shù)反映樣本的物種豐富程度 轉(zhuǎn)色期避雨條件下果實(shí)表面 的真菌豐富度 Sobs 和 Chao1 指數(shù)最高 為 574 33 和 691 88 普遍高于露天對(duì)照 且轉(zhuǎn)色期高于 成熟期 Simpson 指數(shù)與群落中的物種的豐富度和均勻度程度成正相關(guān) Simpson 指數(shù)表明露天對(duì) 照成熟期的真菌多樣性程度最高 而避雨棚轉(zhuǎn)色期最低 2 2 2 細(xì)菌 細(xì)菌群落的測(cè)序覆蓋率 Good s coverage 為 1 表 1 說明測(cè)序結(jié)果的可靠 Sobs 指數(shù)和 Chao1 指數(shù)表明避雨棚轉(zhuǎn)色期的細(xì)菌 多樣性最高 避雨棚成熟期最低 Simpson 指數(shù)表明露天對(duì)照成熟 期的細(xì)菌物種的豐富度低于其他 3 個(gè)處理 表 1 避雨棚和露天栽培的 赤霞珠 葡萄果實(shí)表面真菌和細(xì)菌的 多樣性 Table 1 diversity of bacteria and fungi on the surface of Cabernet Sauvignon grapes cultivated in rain shelter and open fields 處理 Treatment 采收時(shí)期 Sampling stage 真菌 Fungi Sobs Chao1 Simpson 覆蓋率 Good s coverage 避雨棚 轉(zhuǎn)色期 Veraison stage 574 33 691 88 0 78 1 00 Rain shelter 成熟期 Ripening stage 302 00 432 71 0 79 1 00 露天 對(duì)照 轉(zhuǎn)色期 Veraison stage 455 00 572 37 0 81 1 00 Open field Control 成熟期 Ripening stage 301 00 423 71 0 82 1 00 處理 采收時(shí)期 細(xì)菌 Bacteria Treatment Sampling stage Sobs Chao1 Simpson 覆蓋率 Good s coverage 避雨棚 轉(zhuǎn)色期 Veraison stage 1 274 33 2 034 17 0 88 1 00 Rain shelter 成熟期 Ripening stage 414 50 624 63 0 67 1 00 露天 對(duì)照 轉(zhuǎn)色期 Veraison stage 808 17 1 194 15 0 96 1 00 Open field Control 成熟期 Ripening stage 480 33 774 99 0 63 1 00 2 3 避雨栽培對(duì)果實(shí)表面微生物群落結(jié)構(gòu)的影響 真菌群落 PCoA 分析 PCo1 的貢獻(xiàn)率為 30 65 PCo2 為 17 06 圖 3 a 避雨條件下轉(zhuǎn)色 黃 蓉 董 超 姜 嬌 秦 義 劉延琳 宋育陽(yáng) 避雨栽培對(duì) 赤霞珠 葡萄果表微生物多樣性的影響 園藝學(xué)報(bào) 2023 50 3 635 646 641 期與成熟期樣本的重疊部分較大 真菌群落結(jié)構(gòu)較為相似 轉(zhuǎn)色期 避雨栽培樣本聚集在一起 且 與露天對(duì)照距離較遠(yuǎn) 露天成熟期樣本的真菌群落較為分散 與避雨棚成熟期樣本的重疊部分較小 進(jìn)一步說明同一生長(zhǎng)階段 避雨栽培的真菌群落結(jié)構(gòu)與露天對(duì)照有明顯差異 對(duì)于細(xì)菌群落 PCo1 的貢獻(xiàn)度為 32 99 PCo2 為 14 00 圖 3 b 露天成熟期樣本的細(xì) 菌群落較分散 而避雨棚成熟期的細(xì)菌群落分布集中 說明二者細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在一定差異 露天 轉(zhuǎn)色期的果表細(xì)菌群落最集中 與避雨棚轉(zhuǎn)色期的樣本細(xì)菌群落距離較遠(yuǎn) 說明避雨栽培對(duì)轉(zhuǎn)色期 果實(shí)表面的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有明顯影響 圖 3 避雨棚和露天栽培的 赤霞珠 葡萄果實(shí)表面真菌 a 和細(xì)菌 b 群落結(jié)構(gòu)的 PCoA 分析 Fig 3 PcoA analysis of fungal a and bacterial b community structure on the surface of Cabernet Sauvignon grapes cultivated in rain sheltered and open field modes 非度量多維標(biāo)度分析結(jié)果 圖 4 與 PCoA 分析類似 進(jìn)一步驗(yàn)證了避雨栽培可以影響葡萄果 實(shí)表面微生物群落的組成結(jié)構(gòu) 尤其是轉(zhuǎn)色期 圖 4 避雨棚和露天栽培的 赤霞珠 葡萄果實(shí)表面真菌 a 和細(xì)菌 b 群落結(jié)構(gòu)的 NMDS 分析 Fig 4 NMDS analysis of fungal a and bacterial b community structure on the surface of Cabernet Sauvignon grapes cultivated in rain sheltered and open field modes 基于 Welch s t 檢測(cè)轉(zhuǎn)色期避雨棚與露天栽培的葡萄果實(shí)表面微生物群落的差異物種 圖 5 a 對(duì)于真菌群落 轉(zhuǎn)色期避雨栽培的果實(shí)表面枝孢屬 Cladosporium 和青霉菌屬 Penicillium 豐度 Huang Rong Dong Chao Jiang Jiao Qin Yi Liu Yanlin Song Yuyang Investigation of the effect of rain shelter cultivation on the microbial diversity of berry surface for Cabernet Sauvignon grapes 642 Acta Horticulturae Sinica 2023 50 3 635 646 顯著多于露天對(duì)照 而鏈格孢屬 Alternaria 短梗霉屬 Aureobasidium 線黑粉酵母屬 Filobasidium 擲孢酵母菌屬 Sporobolomyces 以及布勒擔(dān)孢酵母屬 Bulleromyces 低于對(duì)照 對(duì)于細(xì)菌群落 避雨棚處理顯著減少了泛菌屬 Pantoea 甲基桿菌屬 Methylobacterium 鞘脂 單胞菌屬 Sphingomonas 和馬賽菌屬 Massilia 等細(xì)菌物種在轉(zhuǎn)色期的定殖 圖 5 b 圖 5 轉(zhuǎn)色期避雨棚與露天 赤霞珠 葡萄果實(shí)表面真菌 a 和細(xì)菌 b 物種差異的 Welch s t 檢測(cè) P 0 05 Fig 5 Welch s t test for differences in fungal a and bacterial b species on the surface of Cabernet Sauvignon grapes in rain shelter and open field modes during veraison stage P 0 05 成熟期的真菌和細(xì)菌群落在處理間存在部分重疊 因此通過 LEfSe 分析和 Welch s t 檢測(cè)來預(yù)測(cè) 各處理間特異的主要菌群 避雨棚成熟期果表的特異的真菌主要是土棲棘殼孢菌 Setophoma Myrmecridium 和棗紅孔韌菌 Porostereum 而對(duì)照組 NR 特有的物種主要是殼針孢屬 Setoseptoria 假裸囊菌屬 Pseudogymnoascus 和 Saccharomyces 酵母屬 圖 6 a 玫瑰單 胞菌屬 Roseomonas 是避雨棚和露天成熟期樣本之間差異顯著的物種 P 3 b 細(xì)菌群落顯著性差異的 Welch s t 檢測(cè) P 3 b Welch s t test of significant differences in bacterial communities P 0 05 3 討論 分析避雨棚與露天栽培的 赤霞珠 葡萄果實(shí)表面真菌物種的組成發(fā)現(xiàn) 從轉(zhuǎn)色期進(jìn)入成熟期 后 避雨條件減少了炭疽菌屬 Colletotrichum 的豐度 炭疽菌可使葡萄感染炭疽病 通過代謝產(chǎn) 生漆酶 導(dǎo)致葡萄酒氧化 Guetsky et al 2005 Cruz Lagunas et al 2020 炭疽菌還能侵染藍(lán)莓 咖啡的漿果 Schilder et al 2013 Jeromel et al 2019 并且降雨會(huì)加重其侵染 Bedimo et al 2012 因此 避雨栽培模式減少炭疽菌屬的豐度 可降低果實(shí)感染炭疽病的發(fā)生 當(dāng)果實(shí)從轉(zhuǎn)色期 進(jìn)入成熟期后 其他真菌物種 如球腔圍屬 Mycosphaerella 和枝孢菌屬 Cladosporium 等真菌 與酵母競(jìng)爭(zhēng)葡萄積累的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)會(huì)加劇酵母屬物種多樣性減少 Liu Howell 2020 從而造成酵 母屬物種數(shù)量在成熟期降低 本研究中 僅在露天栽培對(duì)照的成熟期鑒定出有孢漢遜酵母屬 Hanseniaspora 有研究表明含有孢漢遜酵母屬有助于增強(qiáng)葡萄酒的甜味和果香 Jeromel et al 2019 然而 它作為一種非釀酒酵母對(duì)葡萄酒的影響是相對(duì)的 這主要取決于對(duì)葡萄汁的發(fā)酵接種 策略 Moreira et al 2008 果實(shí)進(jìn)入成熟期后 露天栽培對(duì)照中鏈格孢屬 Alternaria 的豐度上 升 比避雨栽培的高 2 46 鏈格孢能產(chǎn)生鏈格孢酚甲醚 鏈格孢酸等多種有毒真菌代謝物 人和 Huang Rong Dong Chao Jiang Jiao Qin Yi Liu Yanlin Song Yuyang Investigation of the effect of rain shelter cultivation on the microbial diversity of berry surface for Cabernet Sauvignon grapes 644 Acta Horticulturae Sinica 2023 50 3 635 646 動(dòng)物攝入這些真菌毒素可引起急性或慢性中毒 King et al 2011 在蘋果 番茄和藍(lán)莓等其他水 果的研究中也發(fā)現(xiàn)了鏈格孢屬會(huì)導(dǎo)致水果腐爛和縮水 降低果實(shí)品質(zhì)與產(chǎn)量 Cabral et al 2019 Wang et al 2021 本研究中 避雨栽培下成熟期果表的曲霉屬 Aspergillus 和單端孢霉屬 Trichothecium 的豐度普遍高于露天對(duì)照 曲霉屬和單端孢霉屬是產(chǎn)赭曲霉毒素 A OTA 最常 見的霉菌毒素物種 Serra et al 2005 Prieto et al 2007 如果在葡萄汁中占比較高 將很可能導(dǎo) 致葡萄酒富含產(chǎn)赭曲霉毒素 A Serra et al 2005 二者附著在果實(shí)表面很可能轉(zhuǎn)移到葡萄汁中 但是其在葡萄酒發(fā)酵過程中的演變有可能受到其他微生物的抑制從而豐度降低 因而這些微生物對(duì) 葡萄酒質(zhì)量的影響有待試驗(yàn)驗(yàn)證 假單胞菌屬 Pseudomonas 可產(chǎn)生分泌藻酸鹽 纖維素等胞外多糖 將促進(jìn)植物健康生長(zhǎng) Heredia Ponce et al 2021 其存在脂多糖和血紅素過氧化物酶等誘導(dǎo)因子可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng) 抗性等 Aragon et al 2015 還可通過合成吩嗪 1 羧酸 綠膿菌素 硝吡咯菌素等一系列吩嗪 類抗生素抑制在果實(shí)表面定殖的病原生物的生長(zhǎng) Aragon et al 2015 在避雨栽培管理下 假單 胞菌屬的豐度高于對(duì)照 在葡萄轉(zhuǎn)色期和成熟期 避雨栽培可以有效地保護(hù)和促進(jìn)葡萄生長(zhǎng)發(fā)育 以保持對(duì)果實(shí)更好的營(yíng)養(yǎng)支撐 葡萄果表是乳酸菌和醋酸菌的天然儲(chǔ)存庫(kù) 健康的葡萄表面乳酸菌 和醋酸菌的群落數(shù)量一般都在 10 2 10 3 CFU g 1 Barata et al 2012 這對(duì)葡萄成熟后的葡萄酒發(fā) 酵過程中的蘋果酸 乳酸發(fā)酵 malolactic fermentation MLF 非常重要 MLF 有助于增加葡萄酒 的香氣和生物學(xué)穩(wěn)定性 同時(shí)降低葡萄酒尖酸的口感 Sumby et al 2019 有研究發(fā)現(xiàn)厚壁菌門 Firmicutes 包含的細(xì)菌 如鏈霉菌屬 Streptomyce 在葡萄酒發(fā)生 MLF 后可以有效的降低葡萄 酒酸度 Bl ttel et al 2009 且來自厚壁菌門的大多數(shù)細(xì)菌可以產(chǎn)生果膠酶 本研究中發(fā)現(xiàn) 避雨 栽培更有利于厚壁菌門在果表的定殖生長(zhǎng) 增加了其在葡萄成熟后轉(zhuǎn)移到葡萄汁的可能 厚壁菌門 的細(xì)菌在釀酒環(huán)境中生長(zhǎng) 其分泌的果膠酶會(huì)潛在提高葡萄漿果浸漬的出汁率 Zhang et al 2019 不動(dòng)桿菌屬 Acinetobacter 與醋酸細(xì)菌普遍存在于變質(zhì)的葡萄表面 在葡萄酒發(fā)酵時(shí)能代謝產(chǎn)生 乙酸 Prieto et al 2007 乙酸是葡萄酒中的主要揮發(fā)性酸 是葡萄酒的 體溫表 含量超過 1 2 g L 1 可導(dǎo)致葡萄酒變質(zhì) 本研究中 避雨處理成熟期不動(dòng)桿菌屬豐度降低了 3 28 避雨栽培 可能對(duì)預(yù)防葡萄酒揮發(fā)酸含量過高有潛在的作用 根據(jù) 1 年微生物群落的數(shù)據(jù) 發(fā)現(xiàn)避雨處理減少 了對(duì)葡萄生長(zhǎng)或者葡萄酒品格潛在有害的微生物在果表定殖 由于微生物的變化和演替受各種因素 的調(diào)控 不同年度之間可能差異很大 本試驗(yàn)結(jié)果需再次驗(yàn)證 避雨栽培引起了轉(zhuǎn)色期葡萄果表大的真菌和細(xì)菌 多樣性指數(shù)的差異 基于 PCoA 和 NMDS 對(duì) 菌群的 多樣性分析 發(fā)現(xiàn)避雨栽培明顯影響了微生物群在轉(zhuǎn)色期的群落結(jié)構(gòu) 葡萄成熟期時(shí) 隨 著果實(shí)表面積膨大 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如多酚 單寧 花色苷的可利用性將會(huì)增加 Pauline et al 2019 研究發(fā)現(xiàn)這些物質(zhì)能在一定程度上抑制多種微生物和病原菌的生長(zhǎng) 具有很高的生物活性 Nilg n Eniz 2019 因此 推測(cè)成熟期果表較高的生物活性物質(zhì)的可利用性導(dǎo)致微生物群落結(jié)構(gòu)相較于轉(zhuǎn) 色期聚集更加集中 References Ali A Ghani M Li Y Ding H Meng H Cheng Z 2019 Hiseq base molecular characterization of soil microbial community diversity structure and predictive functional profiling in continuous cucumber planted soil affected by diverse cropping systems in an intensive greenhouse region of northern China International Journal of Molecular Sciences 20 11