類芽胞桿菌W51菌劑制備及對(duì)番茄青枯病的防效研究_蔡傅紅.pdf

37 5 982 988 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào) Chinese Journal of Biological Control 2021 年 10 月 收稿日期 2020 10 28 基金項(xiàng)目 國(guó)家自然科學(xué)基金 31772217 江蘇省產(chǎn)學(xué)研合作項(xiàng)目 BY2019170 江蘇省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目 201911049009Z 作者簡(jiǎn)介 共同第一作者 蔡傅紅 碩士研究生 E mail CFHGGS 袁志香 博士研究生 E mail 15950387417 通 信作者 博士 教授 E mail ypwang DOI 10 16409 ki 2095 039x 2021 04 012 類芽胞桿菌 W51菌劑制備及對(duì)番茄青枯病的防效研究 蔡傅紅 1 袁志香 2 史雨琪 2 朱晶鳳 1 韋 歡 1 丁志鵬 1 張彎彎 1 顏歆雯 1 劉紅霞 2 王曉莉 1 王云鵬 1 1 淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院 江蘇省益生菌制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 淮安 223003 2 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 南京 210095 摘要 青枯病是由青枯勞爾氏菌 Ralstonia solanacearum 引起的一種土傳病害 本研究將制備得到的伊利石 吸附 W51 菌劑作用于防治番茄青枯病的溫室試驗(yàn) 結(jié)果表明 伊利石吸附 W51 菌劑中的伊利石最佳劑量 為 4 最佳吸附時(shí)間為 30 min 在該條件下伊利石對(duì)菌體的吸附率達(dá)到 90 78 溫室試驗(yàn)中 伊利石吸 附 W51 菌劑處理組在第 14 d 仍然表現(xiàn)出較好的防效 62 29 遠(yuǎn)高于類芽胞桿菌 Paenibacillus sp W51 菌 懸液處理組的 42 91 本研究表明 伊利石吸附 W51 菌劑相對(duì)于單一的類芽胞桿菌 Paenibacillus sp W51 對(duì)番茄青枯病有較高的防治效果 關(guān) 鍵 詞 番茄青枯病 青枯勞爾氏菌 伊利石 類芽胞桿菌 W51 中圖分類號(hào) S432 1 文獻(xiàn)識(shí)別碼 A 文章編號(hào) 1005 9261 2021 05 0982 07 The Preparation of Paenibacillus sp W51 and Its Control Effect on Tomato Bacterial Wilt CAI Fuhong 1 YUAN Zhixiang 2 SHI Yuqi 2 ZHU Jingfeng 1 WEI Huan 1 DING Zhipeng 1 ZHANG Wanwan 1 YAN Xinwen 1 LIU Hongxia 2 WANG Xiaoli 1 WANG Yunpeng 1 1 School of Life Science and Food Engineering Huaiyin Institute of Technology Jiangsu Key Laboratory of Probiotics preparation Huaian 223003 China 2 College of Plant Protection Nanjing Agricultural University Nanjing 210095 China Abstract Bacterial wilt was a kind soil borne disease which caused by Ralstonia solanacearum In the greenhouse experiment of this study the prepared illite adsored W51 bacteria agent was applied to prevent and treat tomato bacterial wilt The results showed that the optimal dosage of illite in the illite adsored W51 agents was 4 and the optimal adsorption time was 30 min Under the conditions the adsored rate of illite to bacteria could reach 90 78 in the greenhouse experiment Illite adsored W51 agents treatment group still showed better biocontrol effect on Ralstonia solanacearum than the Paenibacillus sp W51 suspension treatment group 42 91 at the 14 th day 62 29 It was proved in this study that illite adsorbed W51 bacteria agent could better prevent and treat tomato bacterial wilt when comparing with Paenibacillus sp W51 Key words tomato bacterial wilt Ralstonia solanacearum illite Paenibacillus sp W51 番茄是我國(guó)重要的蔬菜作物 近年來(lái)生產(chǎn)規(guī)模不斷擴(kuò)大 由青枯勞爾氏菌 R solanacearum 引起的細(xì)菌 性土傳病害 導(dǎo)致番茄產(chǎn)量急劇下降 造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失 1 青枯病原菌可通過(guò)雨水 灌溉 地下蟲害 或操作工具等方式從番茄的根部 莖基部皮孔或傷口侵入并潛伏 條件適宜時(shí)在維管束內(nèi)迅速繁殖 堵塞 導(dǎo)管使植株得不到應(yīng)有的水分和營(yíng)養(yǎng)而萎蔫死亡 2 該病害一旦發(fā)病便難以控制 常造成番茄植株的大面 積枯萎死亡 嚴(yán)重制約了番茄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展 3 4 目前 對(duì)番茄青枯病的防治已有諸多報(bào)道 比如藥劑灌根 作物輪種 抗性育種等 但尚無(wú)穩(wěn)定有效 第 5 期 蔡傅紅等 類芽胞桿菌 W51 菌劑制備及對(duì)番茄青枯病的防效研究 983 的防治措施 5 6 近年來(lái) 生物防治已成為一種安全可靠的病害防治方法 7 8 利用生防菌株如無(wú)致病力青 枯菌 9 假單胞菌 10 11 芽胞桿菌 12 13 等對(duì)番茄青枯病進(jìn)行生物防治的方法已引起廣大科研人員和農(nóng)藥公 司的研究興趣 其中芽胞桿菌是多種病原菌的拮抗菌 能預(yù)防和控制多種作物病害 被普遍認(rèn)為是一種環(huán) 境友好 經(jīng)濟(jì)有效的病害防治途徑 14 15 目前 國(guó)內(nèi)外利用生防菌株防治番茄青枯病取得了一定的研究進(jìn) 展 但仍然缺少高效 低毒 安全的微生物制劑產(chǎn)品 16 伊利石是一種常見的黏土礦物 含有大量金屬陽(yáng)離子如 Fe 2 Mg 2 Si 2 等 17 可以與細(xì)菌細(xì)胞壁表面 的肽聚糖相結(jié)合 此外 伊利石晶體所具有的大比表面積的特征也使得其具備良好的靜電吸附性能 這些 特征使得伊利石在水中能夠聚集細(xì)菌菌體 17 18 但有關(guān)以粘土礦物吸附劑為載體制備的微生物制劑對(duì)番茄 青枯病防治研究鮮有報(bào)道 本研究以伊利石為載體吸附生防菌從而制得微生物制劑 并用于番茄青枯病的 防治 為番茄青枯病的防治提供有效措施 1 材料與方法 1 1 伊利石 伊利石購(gòu)自河南舒山伊利石礦業(yè)開發(fā)有限公司 粒度 2 m Al 2 O 3 32 K 2 O 6 SiO 2 54 TiO 2 Fe 2 O 3 1 自然白度 85 1 2 菌株與培養(yǎng)條件 病原菌選用青枯勞爾氏菌 ZJ3721 由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院提供 類芽胞桿菌 W51 分離自江蘇 省淮安市馬頭鎮(zhèn)番茄種植園土壤 培養(yǎng)青枯勞爾氏菌 ZJ3721 的固體培養(yǎng)基為 YGPA 培養(yǎng)基 19 葡萄糖 10 g 蛋白胨 5 g 酵母提取物 5 g 瓊脂 18 g 用蒸餾水定容至 1 L 調(diào)節(jié) pH 至 7 0 類芽胞桿菌 W51 的固體培養(yǎng)基為 LB 瓊脂培養(yǎng)基 NaCl 10 g 蛋白胨 10 g 酵母提取物 5 g 瓊脂 18 g 用蒸餾水定容至 1 L 調(diào)節(jié) pH 至 7 0 培養(yǎng)青枯勞爾氏菌 ZJ3721 和類芽胞桿菌 W51 的種子液培養(yǎng)基為 YGPB 培養(yǎng)基 葡萄糖 10 g 蛋白胨 5 g 酵母提取物 5 g 用蒸餾水定容至 1 L 調(diào)節(jié) pH 至 7 0 青枯勞爾氏菌 ZJ3721 擴(kuò)繁培養(yǎng)基為 NB 培養(yǎng)基 NaCl 5 g 蛋白胨 10 g 牛肉浸粉 5 g 用蒸餾水定容至 1 L 調(diào)節(jié) pH 至 7 0 類芽胞桿菌 W51 擴(kuò)繁培養(yǎng)基為 PDB 液體培養(yǎng)基 馬鈴薯浸出粉 8 g 葡萄糖 20 g 用蒸餾水定容至 1 L 調(diào)節(jié) pH 至 7 0 1 3 類芽胞桿菌 W51 對(duì)青枯勞爾氏菌 ZJ3721 的抑菌試驗(yàn) 將保存在甘油管中的類芽胞桿菌 W51 于 LB 平板上活化 32 培養(yǎng) 48 h 后接種至 YGPB 液體培養(yǎng)基 中 32 200 r min 振蕩培養(yǎng) 24 h 用無(wú)菌 PDB 液體培養(yǎng)基將菌液稀釋至 1 10 8 CFU mL 將保存在甘 油管中的青枯勞爾氏菌 ZJ3721于 YGPA平板上活化 35 培養(yǎng) 24 h后接種至 YGPB液體培養(yǎng)基中 35 180 r min 振蕩培養(yǎng) 24 h 用無(wú)菌 NB 液體培養(yǎng)基將菌液稀釋至 1 10 8 CFU mL 采用平板對(duì)峙法測(cè)定拮抗 菌類芽胞桿菌 W51 對(duì)青枯勞爾氏菌 ZJ3721 的抑制能力 20 21 取 100 L 青枯勞爾氏菌 ZJ3721 菌懸液均勻 涂布在 LB 平板中 在 LB 平板上放置無(wú)菌濾紙片 加入類芽胞桿菌 W51 菌懸液 空白用無(wú)菌 PDB 液體 培養(yǎng)基做對(duì)照 試驗(yàn)重復(fù) 3 次 35 培養(yǎng) 24 h 后觀察統(tǒng)計(jì)抑菌圈直徑 1 4 類芽胞桿菌 W51 的鑒定 將待測(cè)菌株接種在 NB 培養(yǎng)基中 32 培養(yǎng) 24 h 以 10000 g min 離心 15 min 收集菌體 用細(xì)菌 DNA 提取試劑盒 Promega 美國(guó) 提取所分離類芽胞桿菌 W51 的全基因組 以其為模板進(jìn)行 16S rDNA 基因 的 PCR 擴(kuò)增 擴(kuò)增引物為細(xì)菌 16S rDNA 基因通用引 27F 5 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3 和 1492R 5 GGTTACCTTGTTACGACTT 3 22 24 PCR 反應(yīng)體系 50 L 反應(yīng)體系混合液 25 L 上 下游引 物各 2 L 樣品 DNA 提取液 1 L ddH 2 O 補(bǔ)足至 50 L PCR 反應(yīng)條件 95 預(yù)變性 5 min 95 變性 30 s 60 退火 30 s 72 復(fù)性 90 s 重復(fù) 25 個(gè)循環(huán) 72 延伸 10 min 所得 PCR 產(chǎn)物委托上海美吉 生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序 將 16S rDNA 測(cè)序結(jié)果在 NCBI 上進(jìn)行 BLAST 比對(duì) 再用 MEGA7 0 構(gòu) 建系統(tǒng)發(fā)育樹 1 5 吸附條件篩選 1 5 1 最佳吸附配比篩選 將振蕩培養(yǎng) 24 h的類芽胞桿菌 W51培養(yǎng)液以 1 500接種至 PDB液體培養(yǎng)基中 984 中 國(guó) 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 37 卷 32 200 r min 振蕩培養(yǎng) 36 h 3500 g min 離心 30 min 棄上清 沉淀用無(wú)菌水重懸至 OD 600 0 8 此 時(shí)菌懸液的濃度約為 1 10 9 CFU mL 選取質(zhì)量比為 1 2 3 4 5 6 的伊利石 根據(jù)前期試 驗(yàn)結(jié)果表明所選濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)無(wú)影響 進(jìn)行最佳吸附配比的篩選試驗(yàn) 使用蔗糖密度梯度法 25 測(cè)定不同 比例的伊利石粉對(duì)類芽胞桿菌菌體的吸附效果 向濃度為 1 10 9 CFU mL 的類芽胞桿菌 W51 菌懸液中加入上述配比的無(wú)菌伊利石 于搖床中 32 200 r min 振蕩培養(yǎng) 30 min 取混合液于試管中 向其底部緩慢加入等體積的 60 質(zhì)量濃度的無(wú)菌蔗糖溶液 靜置 2 h 吸附在伊利石上的菌體會(huì)下沉至蔗糖溶液的底部 而未被吸附的菌體則繼續(xù)停留在蔗糖溶液的 上層 吸取上層混合液稀釋涂平板 32 培養(yǎng) 12 h 后計(jì)單菌落數(shù) 計(jì)算吸附率 C 選取最佳吸附率的伊 利石粉添加配比進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn) C 1 m M 100 其中 m 表示加入吸附劑后的混合液在蔗糖 溶液上層的單菌落數(shù) M 表示未加入吸附劑的菌懸液在蔗糖溶液上層的單菌落數(shù) 1 5 2 最佳吸附時(shí)間篩選 選取 10 20 30 40 50 60 min 進(jìn)行最佳吸附時(shí)間的篩選試驗(yàn) 使用蔗糖密 度梯度法測(cè)定不同比例的伊利石粉對(duì)類芽胞桿菌 W51 菌體的吸附效果 向類芽胞桿菌 W51菌懸液中加入已篩選出的最佳配比的無(wú)菌伊利石粉 分別于搖床中 32 200 r min 振蕩培養(yǎng)上述吸附時(shí)間 取混合液于試管中 向其底部緩慢加入等體積的 60 質(zhì)量濃度的無(wú)菌蔗糖溶液 靜置 2 h 后吸取上層液體稀釋涂平板 32 培養(yǎng) 12 h 后計(jì)數(shù)單菌落數(shù)并按公式計(jì)算吸附率 1 6 伊利石吸附 W51 菌劑的制備 將保存在甘油管中的類芽胞桿菌 W51 于 LB 平板上活化 32 培養(yǎng) 48 h 后接種至 YGPB 液體培養(yǎng)基 中 32 200 r min 振蕩培養(yǎng) 24 h 將類芽胞桿菌 W51 培養(yǎng)液以 1 500 接種至 PDB 液體培養(yǎng)基中 32 200 r min 振蕩培養(yǎng) 36 h 后 3500 g min 離心 30 min 棄上清 沉淀用無(wú)菌水重懸至 OD 600 0 8 此時(shí)菌懸 液的濃度約為 1 10 9 CFU mL 向菌懸液中加入 4 的滅菌后的伊利石粉 121 高壓滅菌 20 min 于 搖床中 32 200 r min 振蕩培養(yǎng) 30 min 即為所需的伊利石吸附 W51 菌劑 1 7 溫室防效試驗(yàn) 將番茄種子 品種為上海合作 903 先用無(wú)菌水沖洗兩遍 后用 75 酒精浸泡 2 min 再用無(wú)菌水沖洗 3 遍 消毒后的番茄種子在培養(yǎng)皿中催芽 72 h 后選取發(fā)芽種子播種至穴盆中 當(dāng)番茄苗生長(zhǎng)至 5 6 片真 葉時(shí)選取長(zhǎng)勢(shì)一致的苗轉(zhuǎn)移至盆缽 11 cm 10 cm 8 cm 中 每盆種植 1 株番茄 45 d 后進(jìn)行試驗(yàn)處理 試驗(yàn)設(shè) 3 個(gè)處理 1 空白對(duì)照組 向每盆的番茄根部灌入 20 mL 無(wú)菌水 2 類芽胞桿菌 W51 菌懸 液處理組 向每盆的番茄根部灌入 20 mL 類芽胞桿菌 W51 濃度為 1 10 9 CFU mL 菌懸液 3 伊利 石吸附 W51 菌劑處理組 向每盆的番茄根部灌入 20 mL 伊利石吸附 W51 菌劑 濃度為 1 10 9 CFU mL 7 d 后向每盆的番茄苗灌入 20 mL 青枯勞爾氏菌 ZJ3721 濃度為 1 10 7 CFU mL 每個(gè)處理組有 24 棵番 茄苗 試驗(yàn)重復(fù) 3 次 溫室試驗(yàn)條件為 35 自然光照 在 10 14 d 對(duì)番茄青枯病的發(fā)病情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì) 按照李茹等 27 Hai 等 28 報(bào)道的方法 記錄分析病情指數(shù)和防效 0 級(jí) 無(wú)癥狀 1 級(jí) 1 片葉枯萎 2 級(jí) 2 3 片葉枯萎 3 級(jí) 除底部 2 3 片葉外 其他葉片均枯萎 4 級(jí) 整株葉片枯萎 病情指數(shù) 病級(jí) 數(shù) 該病級(jí)植株數(shù) 最高病級(jí)數(shù) 總植株數(shù) 100 防效 對(duì)照組病害病情指數(shù) 處理組病 害病情指數(shù) 對(duì)照組病害病情指數(shù) 100 1 8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 統(tǒng)計(jì)并計(jì)算吸附率 不同處理組的病情指數(shù)和防效 利用 IBM SPSS Statistics 23 數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行單 因素方差分析 One way ANOVA 數(shù)據(jù)繪圖工作利用 Origin 8 0 完成 2 結(jié)果與分析 2 1 類芽胞桿菌 W51 對(duì)青枯勞爾氏菌 ZJ3721 的抑菌效果 類芽胞桿菌 W51 對(duì)青枯菌 ZJ3721 有較好的抑制效果 圖 1 抑菌圈直徑達(dá)到 3 79 cm 2 2 類芽胞桿菌 W51 的基因測(cè)序分析 測(cè)序獲得菌株 W51 的 16S rDNA 序列長(zhǎng)度為 1436 bp 該序列在 NCBI 上進(jìn)行序列同源性比對(duì) GenBank 登錄號(hào) SUB9552020EDF300401MZ049605 選擇同屬的模式菌株利用 MEGA 7 0 構(gòu)建了系 第 5 期 蔡傅紅等 類芽胞桿菌 W51 菌劑制備及對(duì)番茄青枯病的防效研究 985 A B C A 50 L 類芽胞桿菌 W51 Paenibacillus sp W51 B 10 L 類芽胞桿菌 W51 Paenibacillus sp W51 C 空白對(duì)照 PDB 液體 CK PDB liquid 圖 1 類芽胞桿菌 W51 對(duì)青枯菌 ZJ3721 的抑制作用 Fig 1 Inhibition of Paenibacillus sp W51 on R solanacearum ZJ3721 統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明 菌株 W51 與 GenBank 中報(bào) 道的類芽胞桿菌 Paenibacillus sp KCTC13919 的相似性最高為 99 65 圖 2 初步判斷菌 株 W51 為類芽胞桿菌 2 3 吸附條件優(yōu)化 未加伊利石的菌體由于其密度低于蔗糖 溶液而始終懸浮在蔗糖溶液的上層 在添加伊 利石后菌體吸附在伊利石上 由于伊利石密度 大 吸附在伊利石上的菌體而下沉 圖 3 吸附顯微觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn) 未加入伊利石吸附前 類芽胞桿菌 W51 菌體呈分散狀態(tài) 圖 3C 而加入伊利石吸附后 絕大多數(shù)類芽胞桿菌 W51 菌體在伊利石的附近出現(xiàn)聚集現(xiàn)象 圖 3D 表明伊利石具有良好吸附菌體的能力 W51 Paenibacillus jamilae KCTC1391 T HE981793 Paenibacillus polymyxa JW 21 T DQ513325 Paenibacillus peoriae 3763 T NR042092 Paenibacillus kribbensis AM49 T NR025169 Paenibacillus brasilensis PB172 T NR025106 Paenibacillus terrae AY38 T KX129792 Paenibacillus hunanensis IC32 31 T KY393339 Paenibacillus forsythiae T98 T NR043728 Paenibacillus puldeungensis CAU9324 T NR117451 Paenibacillus timonensis SCTB120 T JN650285 Paenibacillus barengoltzii SAFN 125 T DQ124699 Paenibacillus lemnae MER91 T KT719666 Paenibacillus xylanilyticus KJ 03 T HQ258920 Paenibacillus urinalis 2CB2 T MH158275 Paenibacillus relictisesami KB0549 T NR133806 Paenibacillus azoreducens CM1 T NR025391 Paenibacillus favisporus GMP01 T AY208751 2 Paenibacillus cineris LMG18439 T NR042189 Paenibacillus rhizosphaerae CECAP06 T NR043166 53 100 98 52 91 67 47 59 44 36 74 96 98 90 72 68 44 圖 2 類芽胞桿菌 W51 基于 16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig 2 Phylogenetic relationships between Paenibacillus sp W51based on the 16S rDNA 吸附配比篩選試驗(yàn)結(jié)果表明 在 1 4 的吸附劑比例下 伊利石對(duì)類芽胞桿菌 W51 的吸附效率 顯著增加 分別為 58 05 0 62 78 29 1 60 85 92 0 44 和 90 39 1 29 當(dāng) 伊利石比例超過(guò) 4 時(shí) 吸附率曲線趨于平穩(wěn) 5 時(shí)吸附率為 90 76 1 06 6 時(shí)吸附率為 91 36 0 40 這可以解釋為伊利石對(duì)類芽胞桿菌 W51 的吸附逐漸達(dá)到飽和 圖 4A 因此 選取 4 作 為最佳吸附比例 吸附時(shí)間篩選試驗(yàn)結(jié)果顯示 隨著吸附時(shí)間的延長(zhǎng) 吸附率不斷上升 在吸附時(shí)間為 30 min 時(shí)吸附 率達(dá)到峰值 為 90 78 1 36 隨著吸附時(shí)間的延長(zhǎng) 吸附率呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì) 在 40 50 和 60 min 時(shí)分別為 90 42 1 54 90 06 1 12 和 89 18 1 56 圖 4B 因此 選取 30 min 作為最 佳吸附時(shí)間 986 中 國(guó) 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 37 卷 6 伊利石比例 Proportions of illite 吸附前 Before adsorption C D 靜置 2 h后 After 2 h A 5 4 3 2 1 0 6 5 4 3 2 1 0 靜置 2 h后 After 2 h 伊利石比例 Proportions of illite 吸附后 After adsorption B A 吸附配比篩選靜置 2 h 前 Adsorption ratio screening before standing for 2 h B 吸附配比篩選靜置 2 h Adsorptionratio screening after standing for 2 h C 未添加伊利石顯微效果 Effect without adding illite under the microscopic D 添加伊利石吸附顯微效果 Effect with adding illite under the microscopic 圖 3 伊利石對(duì)類芽胞桿菌 W51 的吸附效果 Fig 3 The adsorption effect of illite on Paenibacillus sp W51 吸附率 Adsorption rate 吸附率 Adsorption rate 注 圖上不同小寫字母表示在 0 05 水平下有顯著差異 Note Data with the different lowercase letters indicated significant difference at 0 05 level 圖 4 最佳吸附條件篩選結(jié)果 Fig 4 Optimal adsorption conditions screening results 2 4 溫室防效試驗(yàn) 空白對(duì)照組番茄植株在青枯勞爾氏菌 ZJ3721 處理第 9 d 開始發(fā)病 至第 14 d 空白對(duì)照組發(fā)病最嚴(yán)重 接種病原菌后 試驗(yàn)組的番茄病情指數(shù)始終顯著低于同一時(shí)期空白對(duì)照組的病情指數(shù) P 0 05 這表明 類芽胞桿菌 W51 菌懸液以及伊利石吸附 W51 菌劑均對(duì)番茄青枯病有顯著的防治效果 且伊利石吸附 W51 第 5 期 蔡傅紅等 類芽胞桿菌 W51 菌劑制備及對(duì)番茄青枯病的防效研究 987 菌劑處理組的番茄病情指數(shù)始終顯著低于同一時(shí)期類芽胞桿菌 W51 菌懸液處理組的病情指數(shù) P 0 05 10 14 d 時(shí)伊利石吸附 W51 菌劑處理組的生防效果高于類芽胞桿菌 W51 菌懸液處理 P 0 05 通過(guò)伊 利石吸附后的類芽胞桿菌 W51 菌體相較于單一類芽胞桿菌 W51 菌體則具有較高的生物防治效果 此外 伊利石吸附 W51 菌劑處理組番茄植株前期 0 9 d 無(wú)發(fā)病現(xiàn)象 比空白對(duì)照組延遲發(fā)病 2 d 比類芽胞 桿菌 W51 菌懸液處理組延遲發(fā)病 1 d 且該處理 10 14 d 內(nèi)對(duì)番茄青枯病的防效始終穩(wěn)定在 69 23 以上 顯著優(yōu)于類芽胞桿菌 W51 菌懸液處理組的 42 91 P 0 05 表 1 表 1 類芽胞桿菌 W51 和伊利石吸附 W51 菌劑對(duì)番茄青枯病的防治效果 Table 1 The control effects of Paenibacillus sp W51 and illite adsorption W51 agents against tomato bacterial wilt 10 d 11 d 12 d 13 d 14 d 處處理 Treatment 病情 指數(shù) Disease index 防效 Control efficacy 病情 指數(shù) Disease index 防效 Control efficacy 病情 指數(shù) Disease index 防效 Control efficacy 病情 指數(shù) Disease index 防效 Control efficacy 病情 指數(shù) Disease index 防效 Control efficacy 空白對(duì)照 CK 34 14 4 86 b 51 39 9 84 c 73 90 4 37 c 80 21 3 76 c 89 34 4 69 c W51 15 27 2 77 a 53 84 a 27 78 1 39 a 44 78 a 31 25 2 09 a 55 89 a 37 48 2 05 a 54 14 a 50 69 8 41 a 42 91 a 伊利石 Illite W51 100 b 9 71 1 58 b 80 32 b 15 83 1 81 b 78 43 b 21 87 1 05 b 72 64 b 27 43 1 59 b 69 23 b 注 數(shù)據(jù)用平均值 標(biāo)準(zhǔn)誤差表示 同一列不同字母表示有顯著差異 P 0 05 Note Data were presented as mean SD there was a significant difference in the different letters of the same column P 0 05 3 討論 番茄青枯病是番茄維管束系統(tǒng)性病害之一 發(fā)病嚴(yán)重時(shí)造成植物青枯死亡 導(dǎo)致嚴(yán)重減產(chǎn)甚至絕收 29 目前國(guó)內(nèi)外已有許多利用生防菌株防治番茄青枯病 從而降低青枯病侵染番茄而造成的影響 如喬俊卿等 30 篩選出的枯草芽胞桿菌 Bs916 對(duì)番茄進(jìn)行灌根處理 可有效減輕番茄的青枯病 防效達(dá)到 55 60 王麗麗 等 30 施用拮抗菌株處理 3 次 番茄青枯病的田間防治效果達(dá)到 43 Frey 等 32 利用無(wú)致病力青枯菌進(jìn)行番 茄青枯病的防治 也有較好 的防效 本研究主要是利用伊利石吸附類芽胞桿菌 W51 制得的伊利石吸附 W51 菌 劑對(duì)番茄青枯病的防治 其防治效果達(dá)到 69 23 相對(duì)于其他單一生防菌對(duì)番茄青枯病有較高的防治效果 許多生防菌在實(shí)際應(yīng)用時(shí)顯現(xiàn)出受環(huán)境因素影響大 防效不佳 防效時(shí)間短等問題 郭堅(jiān)華等 33 認(rèn)為 抑菌能力強(qiáng)的菌株 如果在生防應(yīng)用受到外界壞境條件的影響 防治效果就會(huì)不理想 近年來(lái) 隨著材料 科學(xué)的發(fā)展 粘土類礦物表面的物化性質(zhì)不斷被闡明 利用粘土礦物為載體富集菌體可以使得生防菌免受 外界不良環(huán)境的影響 進(jìn)而更好地發(fā)揮出生防菌株的防治潛力 伊利石是一種常見的粘土礦物 其表面帶 有大量的陽(yáng)離子 可以與細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖相結(jié)合 吸附大量的芽胞桿菌 34 本研究發(fā)現(xiàn) 將單一的類 芽胞桿菌 W51 用于防治番茄青枯病 其生防效果為 42 91 但用伊利石吸附類芽胞桿菌 W51 制得的伊利 石吸附 W51 菌劑用于番茄青枯病防治 其生防效果達(dá)到 69 23 為了保證伊利石吸附 W51 菌劑能夠更好 地發(fā)揮生防作用 還需要在今后的工作中進(jìn)行防治番茄青枯病的田間試驗(yàn) 并進(jìn)一步研究伊利石吸附 W51 菌劑對(duì)土壤生態(tài)壞境和田間微生物種群結(jié)構(gòu)及數(shù)量的變化 本研究開發(fā)的伊利石吸附 W51 菌劑可以為以 后的研究工作提供參考 參 考 文 獻(xiàn) 1 鄭韋唯 番茄青枯病拮抗內(nèi)生放線菌的分離及抗菌活性產(chǎn)物研究 D 哈爾濱 東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018 2 孟凡燕 劉淑新 溫室番茄青枯病發(fā)生特點(diǎn)及綜合防治技術(shù) J 吉林蔬菜 2008 2 42 43 3 鄭雪芳 劉波 朱育菁 等 番茄青枯病生防芽胞桿菌的篩選與鑒定 J 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào) 2016 32 5 657 665 4 楊勝文 酉陽(yáng)縣番茄青枯病發(fā)生防治現(xiàn)狀及嫁接防治技術(shù)簡(jiǎn)介 J 南方農(nóng)業(yè) 2016 10 22 92 94 5 謝秀明 沈虹 孫錦 番茄青枯病綜合防治研究進(jìn)展 J 中國(guó)果菜 2018 38 11 69 73 6 Shen T Lei Y Pu X et al Identification and application of Streptomyces microflavus G33 in compost to suppress tomato bacterial wilt disease J Applied Soil Ecology 2021 157 103724 988 中 國(guó) 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 37 卷 7 尹維 廖曉蘭 植物源活性物防治作物細(xì)菌性青枯病研究進(jìn)展 J 微生物學(xué)雜志 2013 33 4 84 87 8 項(xiàng)君 現(xiàn)代生物技術(shù)在作物病蟲害防治中的應(yīng)用 J 中國(guó)農(nóng)業(yè)信息 2017 13 56 57 9 鄭雪芳 劉波 朱育菁 等 青枯菌無(wú)致病力菌株 FJAT 1458 與強(qiáng)致病力株 FJAT 91 的競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)作用 J 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào) 2019 35 1 75 80 10 Nion Y A Toyota K Recent trends in control methods for bacterial wilt diseases caused by Ralstonia solanacearum J Microbes and Environments 2015 30 1 1 11 11 Yendyo S Ramesh G C Pandey B R Evaluation of Trichoderma spp Pseudomonas fluorescens and Bacillus subtilis for biological control of Ralstonia wilt of tomato J F1000 Research 2018 6 1 22 12 Wan T Zhao H Wei W Effects of the biocontrol agent Bacillus amyloliquefaciens SN16 1 on the rhizosphere bacterial community and growth of tomato J Journal of Phytopathology 2018 166 5 324 332 13 張斌 喬俊卿 梁雪杰 等 番茄枯萎病菌和青枯病菌拮抗細(xì)菌的評(píng)價(jià) J 植物保護(hù)學(xué)報(bào) 2015 42 3 353 361 14 王麗麗 周旭東 李國(guó)安 等 番茄青枯病病原菌拮抗菌株的篩選及其田間防控作用研究 J 植物保護(hù) 2017 43 1 182 185 15 Shen M Xia D Yin Z et al Bacillus pumilus WP8 exhibits biocontrol efficacy against tomato bacterial wilt via attenuation of the virulence of the pathogenic bacterium J Acta Agriculturae Scandinavica Section B Soil and Plant Science 2017 68 5 1 9 16 賀字典 高玉峰 生防菌在植物病害防治中的研究進(jìn)展 J 河北職業(yè)技術(shù)師范學(xué)院學(xué)報(bào) 2003 17 2 56 59 17 劉盼 扶詠梅 殷世強(qiáng) 等 伊利石吸附處理重金屬?gòu)U水研究展望 J 平頂山學(xué)院學(xué)報(bào) 2016 31 5 55 58 18 Nemec S Datnoff L E Strandberg J Efficacy of biocontrol agents in planting mixes to colonize plant roots and control root diseases of vegetables and citrus J Crop Protection 1996 15 8 735 742 19 王小兵 駱永明 劉五星 等 BZ6 1 菌株在制備治療植物花生青枯病藥物中的應(yīng)用 P 中國(guó)發(fā)明專利 2011 CN102018000A 20 李威 肖熙鷗 李可 等 茄子青枯病拮抗放線菌 XL 6 的篩選 鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化 J 微生物學(xué)通報(bào) 2018 45 2 357 367 21 楊冬靜 張成玲 徐振 等 一株解淀粉芽胞桿菌的分離鑒定及其生物學(xué)特性研究 J 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) 2017 29 9 69 74 22 牛艷芳 閆偉 陳立紅 等 阿爾山國(guó)家森林公園自然保護(hù)區(qū)楊樹根際土壤固氮菌多樣性及特性研究 J 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào) 自然科學(xué)版 2018 46 3 79 86 23 Rawal I Joshi H Chaudhary B L Water quality assessment using physicochemical and bacteriological parameters of Fateh Sagar lake Udaipur India J Water Resources 2018 45 3 427 435 24 Zhou X Z Gao H Li M et al Cultivable bacterial diversity of Paris polyphylla var chinensis with 16S rRNA sequence analysis J Chinese Traditional and Herbal Drugs 2017 48 18 3807 3814 25 Yee N Fein J B Daughney C J Experimental study of the pH ionic strength and reversibility behavior of bacteria mineral adsorption J Geochimica et Cosmochimica Acta 2000 64 4 609 617 26 Swanson J K Montes L Mejia L et al Detection of latent infections of Ralstonia solanacearum race 3 biovar 2 in geranium J Plant Disease 2007 91 7 828 834 27 李茹 李水利 安德榮 等 解淀粉芽胞桿菌菌劑對(duì)番茄青枯病的防治效果 J 中國(guó)植保導(dǎo)刊 2015 35 9 57 58 28 Hai T T Esch E Wang J F Resistance to Taiwanese race 1 strains of Ralstonia solanacearumin wild tomato germplasm J European Journal of Plant Pathology 2008 122 4 471 479 29 黎起秦 羅寬 林緯 等 內(nèi)生菌 B47 的定殖能力及其對(duì)番茄青枯病的防治作用 J 植物保護(hù)學(xué)報(bào) 2006 4 363 368 30 喬俊卿 陳志誼 梁雪杰 等 枯草芽胞桿菌 Bs916 防治番茄青枯病 J 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào) 2016 32 2 229 234 31 王麗麗 李洋 林樂志 抑制番茄青枯病拮抗菌株的田間生防效果 J 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018 59 2 291 292 32 Frey P Prior P Marie C et al Hrp mutants of Pseudomonas solanacearum as potential biocontrol agents of tomato bacterial wilt J Applied and Environmental Microbiol