甜瓜細菌性果斑病病菌鑒定及不同材料抗病性測定.pdf

甜瓜細菌性果斑病病菌鑒定及不同材料抗病性測定 劉夢華 盧霞 李騰 李永博 樊文義 司龍亭 李文虎 阿門 江蘇綠港現(xiàn)代農業(yè)發(fā)展有限公司 江蘇宿遷 摘要 為明確近幾年江蘇地區(qū)甜瓜葉片及瓜上發(fā)生的某一細菌性病害 以江蘇綠港現(xiàn)代農業(yè)發(fā)展有限公司設施大棚中甜瓜發(fā)病葉片為 研究對象 經分離純化得到菌株LG 觀察病菌形態(tài)初步判定該病原菌為甜瓜細菌性果斑病菌 為進一步明確該病菌 分別用 對細菌 性果斑病菌通用標記 BX BX S RC和WFB 對甜瓜細菌性果斑病菌特異性標記 c c c 及 6S測序進行分析 結果表明 菌株LG 為燕麥嗜酸菌西瓜亞種 Acidovorax avenae subs citrulli 苗期和坐果期對西甜瓜部分材料接種菌株LG 結果發(fā) 現(xiàn)菌株LG 對西甜瓜都有致病性 該研究不僅有利于進一步了解甜瓜細菌性果斑菌的特性 為果斑病的防治提供參考 而且也有助于 甜瓜抗病品種的選育 關鍵詞 甜瓜 細菌性果斑病菌 分離純化 抗病材料 中圖分類號 S 6 文獻標識碼 文章編號 66 6 doi 6 j issn 66 6 開放科學 資源服務 標識碼 OSID Identification of Bacterial Fruit Blotch Pathogen and Detection of Different Resistant Plant Materials in Melon LIU Meng hua LU Xia LI Teng et al i ngsu G een o ode n g icu u e Deve o men Co L d Suqi n i ngsu Abstract To iden ify e ogen c using e ves nd f ui s dise se in me on ese ye s in i ngsu P ovince dise sed m e i s we e s m ed f om so g een ouse of i ngsu G een o ode n g icu u e Deve o men Co L d n is s udy e iso ed ogen n med LG w s u ified nd ini i y iden ified s me on B c e i F ui B o c BFB ogen b sed on i s co onies mo o ogic c c e iz ion Fu e fou i s of common y used BFB m ke s BX BX S RC nd WFB s we s ee i s of me on s ecific BFB m ke s c c nd c we e used fo mo ecu c c e iz ion n ddi ion D sequencing of LG w s e fo med b sed on 6S m ified f gmen s Toge e LG w s u im e y confi med s s in of Acidovorax avenae Subs citrulli c w s found LG w s o genic o me on nd w e me on u on inocu ing i o some of ei n s m e i s du ing seed ing nd f ui se ing e iod T is s udy no on y e s o mo e unde s nding e c c e is ics of BFB bu so ovides esis n ines o me on b eeding og m w i e cons i u ing efe ence fo e even ion nd e men of BFB Key words e on B c e i f ui b o c so ion nd u ific ion Resis n m e i s 基金項目 年宿遷市產業(yè)發(fā)展引導資金 自然科學資金 K 作者簡介 劉夢華 女 河南洛陽人 助理農藝師 從事分子輔 助育種和種子純度鑒定研究 盧霞 女 甘肅天水 人 助理農藝師 碩士 從事分子輔助育種和種子純度鑒定 研究 劉夢華和盧霞為共同第一作者 通信作者 副研 究員 博士 從事作物遺傳育種研究 收稿日期 6 甜瓜 Cucumis melo 為葫蘆科甜瓜屬一年生蔓性草本植 物 是我國最早利用為果品的瓜類 世界各地廣泛栽培 我 國甜瓜栽培面積也在逐漸增加 但隨著全球氣候變暖及設施 大棚的普及 甜瓜病害的種類也逐年增多 其中細菌性果斑 病對甜瓜的危害特別嚴重 造成甜瓜大范圍的減產甚至絕 產 該病最早于 6 年在佛羅里達州發(fā)現(xiàn) 年 Sc d等 將其病原菌鑒定為西瓜燕麥嗜酸菌 Acidovorax citrulli 劉丹丹等 通過在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)該病原菌 后觀察其形態(tài)呈圓形 直徑 mm 乳白色 半透明 光滑菌 落 李俊閣等 對甜瓜苗期接種果斑病菌 發(fā)現(xiàn)該病害發(fā)病 初期子葉出現(xiàn)水漬狀病斑 從葉脈開始發(fā)展直至葉片失綠 病斑周圍有黃色暈圈或壞死 于海博等 6 在遼寧西甜瓜上 也發(fā)現(xiàn)細菌性果斑病 該病害不僅危害西甜瓜葉片 而且也 危害果實 在葉片上初期為水漬狀病斑 后逐漸壞死且病斑 周圍有黃色暈圈 果實感病時 初期呈綠褐色水漬狀病斑 隨 后病斑擴大病菌侵入果肉組織造成水浸狀 褐腐或木栓化 6年 cks in Leiv等 在以色列甜瓜上發(fā)現(xiàn)細菌性果斑 病菌株 6 年P k等 在韓國西瓜上也發(fā)現(xiàn)了該細 菌性果斑病菌株K CC 我國海南 新疆 內蒙 古 山東 等地區(qū)也都在西甜瓜上發(fā)現(xiàn)并分離出該病原 菌 但江蘇地區(qū)很少報道 甜瓜細菌性果斑病具有發(fā)病迅 速 傳播速度快 暴發(fā)性強 防病難等特點 已成為影響我國 瓜類生產的主要病害之一 對甜瓜生產造成了巨大的經濟損 失 該病原菌可通過傷口和氣孔侵染瓜類子葉和果實 高溫 高濕極易發(fā)病 一旦發(fā)病將難以控制 如何有效地防治細 菌性果斑病成為生產中的重中之重 目前我國主要通過化 學藥劑防治細菌性果斑病 但使用的大部分農藥效果不是很 理想 且對環(huán)境污染較大 容易產生抗藥性 所以篩選果斑 病抗性品種是廣大育種工作者目前亟待解決的問題 隨著分子生物學和生物信息學的發(fā)展 許多用于細菌種 類鑒定的分子標記被開發(fā) 利用這些分子標記能夠快速 準 確地檢測和鑒定該病原菌 韓盛等 使用擴增細菌 TS序列 的通用引物L L 證實引起新疆甜瓜發(fā)病的 個病原菌均 為嗜酸菌燕麥西瓜亞種 Acidovorax avenae subs citrulli 吉 訓聰?shù)?使用細菌通用引物 6S D 將甜瓜菌株鑒定為嗜 酸菌燕麥西瓜亞種 Acidovorax avenae subs citrulli Wi ems 年B 等 用 對分子標記BX BX S RC鑒定葫 蘆科細菌性果斑病菌 年W co 等 用分子標記WFB 鑒定細菌性果斑病菌 年 s m等 用 對分子標記 c c 和 c 鑒定甜瓜細菌性果斑病菌 筆者 以發(fā)病甜瓜葉片為研究對象 通過病菌分離純化 形態(tài)學觀 察 分子標記檢測及 6S R 基因測序分析等方法 鑒定所 分離的甜瓜葉片病原菌 并通過致病性接種檢測試驗篩選出 抗病的甜瓜種質資源 為甜瓜育種提供參考 安徽農業(yè)科學 n ui g ic Sci 6 1 材料與方法 1 1 試驗材料 1 1 1 甜瓜細菌性果斑病標本的采集 年 月在江蘇 綠港現(xiàn)代農業(yè)發(fā)展有限公司 簡稱 江蘇綠港 拱棚采集病葉 帶回實驗室進行分離純化 1 1 2 西甜瓜材料 哈密瓜類 份 玉菇類 份 羊角脆類 型 份 厚皮甜瓜 份 薄皮甜瓜 份 西瓜 份材料均由 江蘇綠港育種研究所提供 供試材料定植于單棟拱棚 依照 江蘇綠港西甜瓜作物栽培管理標準體系進行栽培管理 1 1 3 培養(yǎng)基 分離培養(yǎng)用K B固體培養(yǎng)基 g胰蛋白 胨 g硫酸鎂 g丙三醇 g瓊脂 g磷酸氫二鉀 定 容至 mL H 搖菌用 B液體培養(yǎng)基 g牛肉膏 g蛋白胨 定容至 mL H 1 2 試驗方法 1 2 1 病原菌分離 純化 將采集的病葉用自來水沖洗病斑 表面 晾干 在生物安全柜中用已滅菌的剪刀將葉片病健交 界處組織剪至 mm片段 先用 乙醇沖洗 s 無菌水 沖洗 s 重復 次 晾干 將葉片組織放在K B固體培養(yǎng) 基上 每皿 6片組織 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) 用 L滅菌的槍頭挑取葉片邊緣的菌落至新的K B固體培 養(yǎng)基上 劃線培養(yǎng) 放入 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) 選取單 菌落進行純化培養(yǎng) 挑單菌落至加入氨芐抗生素的K B固 體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng) 如此重復 次 挑取單菌落至加入氨 芐抗生素的 B液體培養(yǎng)基中搖菌 置于 min恒 溫振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng) 將純化后的菌株保存在冰箱 中待用 1 2 2 病原菌形態(tài)觀察 將分離純化后的菌株接種于K B 培養(yǎng)基上 于 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 觀察菌落形態(tài) 大小 透明度及表面光滑程度等性狀 1 2 3 病原菌PCR檢測 PCR擴增時采用的反應體系為 L體系 其中菌液 L Taq s e ix Dye L 正反引物各 L 加入滅菌的超純水至 L PCR反應程 序 預變性 min 然后進行 個循環(huán) 每個循環(huán)包括 變性 s 退火 s 延伸 s 最后延伸 min 置于 保存 PCR檢測時引物 表 為 對細菌性 果斑病菌通用標記 BX BX S RC和WFB 及 對甜瓜細 菌性果斑病菌特異性標記 c c c PCR 產物在加有溴化乙錠 B 的 瓊脂糖凝膠進行電泳 電泳 緩沖液為 T 緩沖液 電壓為 v 電泳結束后在凝膠 成像分析儀中觀察電泳條帶 在 6 nm波長下分析D 電 泳條帶大小 掃描圖像并保存 1 2 4 6S R 擴增及基因測序分析 用細菌通用引物 F G GTTTG TCCTGGCTC G 和 R GGT T CCTTGTT CG CTT 對分離病菌進行PCR擴增 PCR 反應體系 L 菌液 L Taq s e ix Dye L 正反引物各 L 加入滅菌的超純水至 L PCR 反應程序 預變性 min 然后進行 個循環(huán) 每個循環(huán)包 括 變性 s 退火 s 延伸 s 最后延伸 min 反應結束后 吸取 L在 的瓊脂糖凝膠電泳上 檢測 表1 用于檢測果斑病菌的PCR引物和反應條件 Table 1 Sequence of primer pairs used for detection of A citrulli strains causing BFB disease based on polymerase chain reac tion PCR assays 標記名稱 P ime n me 序列 P ime sequence 標記大小 m icon size b 退火溫度 nne ing condi ion BX F C GCTGGG GCG TCTTC T R C TG GGGGT GGCC GGT 6 BX S F C GCTGGG GCG TCTTC T R GCGTC GG GGGTG GT GC RC F CGGTCTTCG CCTG CGCT R C GCTTCTTTCCC GC C WFB F G CC GCC C CTGGG C R CTGCCGT CTCC GCG T 6 c F GC TCCGGTGTGCTGCTGG R G G TGTC G GTCGC CGGT 6 c F GGCGG C TGGGTTGGCT R CTGCGCCTGCGCCC C CC c F TCGCGGGCCGTG TGTTCCG R TGG CTTCGGGTGGGCCTTC 用PCR產物純化試劑盒純化回收PCR產物 與 D T載體連接 連接產物轉化大腸桿菌DH 感受態(tài)細胞 篩選陽性克隆 PCR法鑒定是否含有外源目標插入片段 將 含有目標D 的轉化子進行測序 測序工作由杭州尚亞塞 生物技術有限公司完成 利用D 生物信息學軟件 對獲得的序列進行比對 1 2 5 致病性測定及甜瓜材料抗性鑒定 將分離純化的菌 株在 B液體培養(yǎng)基中搖菌 待搖渾后 將菌株配成 CFU mL的菌懸液 隨機選取 份甜瓜材料 份西 瓜材料進行致病性測定和甜瓜抗性試驗 每份材料播種 粒 兩葉一心定植 甜瓜和西瓜緩苗結束后 在苗齡為 6葉 期時 將菌懸液用噴霧法接種至西甜瓜葉片上 以無菌水噴 霧作對照 接種后加大棚內的溫濕度 隔 d觀察記錄發(fā) 病情況 2 結果與分析 2 1 病害癥狀 江蘇綠港甜瓜田間調查發(fā)現(xiàn) 感病甜瓜初期 葉片出現(xiàn)不規(guī)則褐色斑點 葉脈先發(fā)病逐漸向整個葉片蔓 延 果實癥狀比較明顯 初期出現(xiàn)水漬狀病斑 逐漸擴大成水 漬狀大斑 侵入果肉引起果肉腐爛 圖 和b 2 2 菌株形態(tài)特征 將所采病樣 份經 次單菌落的分離 純化 通過菌落形態(tài)觀察 結果得到 株菌株 編號為LG 菌株在K B培養(yǎng)基上形成多菌落 且菌落形態(tài)單一 菌落 呈凸狀 光滑至略帶顆粒 乳白色 邊緣帶半透明 圖 c 2 3 分子鑒定 為了明確分離得到的菌株LG 是否是瓜 類細菌性果斑病 利用 對細菌性果斑病通用標記BX BX S RC WFB對菌株LG 進行PCR擴增 經瓊脂糖凝膠電 泳分別擴增出 6 6 b 的條帶 圖 d 且?guī)颓?晰 該結果與之前報道的結果一致 表明菌株LG 為細菌性 果斑病菌 為了進一步驗證其是否為甜瓜細菌性果斑病菌 6 安徽農業(yè)科學 年 利用 對甜瓜細菌性果斑病特異性標記 c c c 對菌株LG 進行PCR擴增 其結果與之前文獻報 道的結果一致 同樣擴增出了大小分別為 b 清 晰片段 圖 e 注 BX BX S RC WFB 6S 6 c c c 圖1 甜瓜細菌性果斑病分離純化和PCR鑒定 Fig 1 Isolation purification and PCR identification of BFB pathogen 2 4 16S rRNA基因測序分析 對菌株LG 的 6S D 序列進行PCR擴增 獲得了 b 的PCR產物 圖 d 將PCR產物回收測序 測序結果通過 CB 數(shù)據庫進行 BL ST同源性比對 s b s ncbi n m ni gov B s cgi 菌株LG 與已報道的燕麥嗜酸菌西瓜亞種具有高度 同源性 即與K CC 序列同源性達 與 C 和 6 序列同源性高達 說明菌株LG 也屬 于燕麥嗜酸菌西瓜亞種 A avenae subs citrulli 2 5 病原菌的致病性鑒定及甜瓜抗性鑒定 將菌株LG 分別在苗期和坐果期接種到西甜瓜上 d后觀察西甜瓜葉 片均有發(fā)病 且發(fā)病癥狀與上述描述的甜瓜細菌性果斑病的 癥狀一致 圖 再次對西甜瓜發(fā)病葉片和果實進行分離 純化 得到與菌株形態(tài)特征相同的菌株 表明菌株LG 可能 為細菌性果斑病病原菌 注 b c為甜瓜抗病材料 d e f為甜瓜感病材料 g 為西瓜感病材料 o e b c Resis n me on n m e i s d e f Susce ib e me on n m e i s g Susce ib e w e me on n m e i s 圖2 甜瓜和西瓜材料致病性檢測結果 Fig 2 Result of inoculation test of melon and watermelon materials 由表 可知 在所有供試甜瓜類型中發(fā)病情況有明顯的 差別 哈密瓜類型的 份材料 都表現(xiàn)出感病 玉菇類 的 份材料中 有 份表現(xiàn)出不同程度的抗病情況 份表 現(xiàn)感病 有可能因為這 份感病材料與其他 份玉菇類的 材料無親緣關系 羊角脆類型的 份材料中 份表現(xiàn)出不同 程度的抗病性 份表現(xiàn)出感病 這主要是由于個體存在差異 性 其他 份薄皮甜瓜均表現(xiàn)出抗性 總體而言 甜瓜薄皮 系列 玉菇類具有較強的抗性 哈密瓜類型比較容易感病 由于厚皮甜瓜類型多 控制甜瓜性狀的基因也多 其抗感性 不易確定 3 結論與討論 甜瓜細菌性果斑病主要侵染甜瓜的植株 果實和種子 造成苗期死亡或者果實腐爛等嚴重現(xiàn)象 對甜瓜育種及生產 者造成巨大的影響 該研究采集江蘇綠港疑似甜瓜細菌性 果斑病病葉 份 對其進行分離純化 獲得 株菌株LG 用 對細菌性果斑病相關標記BX BX S RC WFB c 卷6期 劉夢華等 甜瓜細菌性果斑病病菌鑒定及不同材料抗病性測定 表2 甜瓜細菌性果斑病抗性測定結果 Table 2 Test results of melon BFB disease resistance 類型 Ty e 甜瓜材料 e on m e i s 抗性 Resis nce 類型 Ty e 甜瓜材料 e on m e i s 抗性 Resis nce 羊角脆類 C unc y me on L R 哈密瓜類 C n ou e L S L S L S L S L S L 6 R L S L R L S L R L 6 S L R L S 玉菇類 Yugu musk me on L R L S L R L S L R L R L 6 R 厚皮甜瓜 T ick skinned muskme on L R L R L S L 6 R L S L 6 R L R L R L R L R L R L S L S L S L S L S L S L S L R L S薄皮甜瓜 T in skinned muskme on L R L R L R L R L R L R L R L S L S 注 R 高抗 R 抗 R 低抗 S 高感 S 感 o e R Hig esis nce R Resis nce R Low esis nce S Susce ibi i y S Hig susce ibi i y c 及 c 對菌株LG 進行PCR擴增檢測 PCR擴 增產物經過瓊脂糖凝膠電泳 均顯示出清晰條帶 且經 6S D 測序分析結果表明該菌株LG 與之前西瓜上分離出 的 CC K C 菌株和甜瓜上分離出的 6菌株均 具有高度的同源性 將分離純化得到的菌株LG 回接到健 康甜瓜 西瓜幼苗上 接種結果表明 該菌株LG 能引起健 康甜瓜 西瓜植株發(fā)病 筆者對接種后發(fā)病西甜瓜植株葉片 再次分離純化 得到與菌株LG 在菌落形態(tài)等方面一致的 菌株 且發(fā)病葉片癥狀與田間發(fā)病癥狀相同 由此確定該菌 株LG 可能是引起江蘇地區(qū)西甜瓜的細菌性果斑病菌 s m等 利用其自主開發(fā)的 對甜瓜細菌性果斑病特異的 標記 c c 和 c 對甜瓜菌株 HHS 和K CC 進行PCR擴增檢測 發(fā)現(xiàn)其能擴增出清晰的 目標片段 田間接種甜瓜 西瓜等材料 結果只在甜瓜上發(fā) 病 而在西瓜上不發(fā)病 因此 s m等 認為菌株 HHS 和K CC 對甜瓜具有高度毒性而對西瓜基本無毒 性 s m等 用同樣的 對標記對 株西瓜菌株 CC K C 也進行了PCR擴增 未擴增出目標條帶 而該 研究發(fā)現(xiàn) 用 對 s m等 開發(fā)的標記 c c c 對LG 進行PCR擴增 均擴增出了目標片段 且與 s m等 從甜瓜上分離菌株 HHS 和K CC 擴增的條帶大小相同 且田間接種試驗表明該菌株LG 不 僅能侵染甜瓜而且能引起西瓜發(fā)病 該研究利用標記 6S 僅對保守細菌基因進行測序 而不是對整個基因組進行測 序 因此序列相似性結果可能會產生偏差 從而影響序列分 析的可靠性 將PCR檢測 6S序列分析以及田間致病性結 果綜合起來 菌株LG 可能與菌株 HHS 和 K CC 相同或存在差異 另外 試驗條件和材料背景也可 能會影響菌株的致病性 為了篩選抗細菌性果斑病的甜瓜種質資源 該研究對 份甜瓜材料接種菌株LG 進行致病性檢測 觀察苗期發(fā)病 情況 在供試的甜瓜材料中 甜瓜類型與抗性之間存在一定 差異 哈密瓜類比較容易感病 玉菇類甜瓜總體上都表現(xiàn)出 一定的抗病性 羊角脆類甜瓜中 抗病 其中有 份材料 表現(xiàn)感病 可能因為個體的差異性 由于環(huán)境及設施條件可 能達不到菌株最適宜的生長環(huán)境 抗感材料觀察結果可能會 有一定的誤差 后期會進一步克服外界因素 進行大規(guī)模甜 瓜抗性篩選試驗 該研究可為甜瓜細菌性果斑病抗病基因 QTL定位奠定基礎 將來可以選取更多甜瓜材料 包括該研 究中已選擇的材料 設計 種不同的甜瓜栽培模式 露地栽 培 日光溫室栽培和拱棚栽培 進行大規(guī)模的甜瓜抗性篩選 試驗 參考文獻 魯思夢 王賢磊 寧雪飛 等 甜瓜 R 細菌性果斑病抗病基因QTL 定位分析 分子植物育種 CR LL SCH CK C B c e i f ui o of w e me on in F o id P n dise se e o e 6 SCH D W POST KO S CHL R e Rec ssific ion of subs ecies of Acidovorax avenae s A avenae nns emend A cattleyae P v ino comb nov A citrulli Sc d e comb nov nd o os of A oryzae s nov Sys em ic nd ied mic obi o ogy 6 6 劉丹丹 劉暢 甜瓜細菌性果斑病菌鑒定及殺菌劑毒力測定 北方園 藝 6 李俊閣 王惠林 張亮 等 種子接種果斑病菌對不同甜瓜幼苗生長的影 響 北方園藝 6 6 于海博 畢馨月 夏博 等 遼寧西瓜和甜瓜細菌性果斑病的病原鑒定 沈陽農業(yè)大學學報 CKSHT L SHK DY D G RSHO TS e nsig s f om e genome sequence of Acidovorax citrulli 6 g ou s in of e c us gen of b c e i f ui b o c of cucu bi s F on ie sin mic obio ogy 6 P RK H S O G H SUL W e Com e e genome sequence of Aci dovorax citrulli s in K CC c us gen fo b c e i f ui b o c on w e me on Ko e n jou n of mic obio ogy 吉訓聰 肖彤斌 黃偉明 等 海南甜瓜細菌性果斑病病原菌鑒定 廣 東農業(yè)科學 韓盛 楊渡 玉山江 麥麥提 等 新疆籽瓜細菌性果斑病的發(fā)生與分 子鑒定 新疆農業(yè)科學 6 6 趙廷昌 趙洪梅 王懷松 山東省西瓜 甜瓜發(fā)生瓜類細菌性果斑病 植物保護 B H R O FR T H D R e ew subs ecies s ecific o yme se c in e c ion b sed ss y fo e de ec ion of Acidovorax avenae sub s citrulli P n o ogy 6 W LCOTT R R G T T S R D De ec ion of Acidovorax avenae subs ci u i in w e me on seed using immunom gne ic se ion nd e o yme se c in e c ion P n dise se SL R HOSS R K H T e Deve o men of mo ecu m ke s fo de ec ion of Acidovorax citrulli s ins c using b c e i f ui b o c dise se in me on n e n ion jou n of mo ecu sciences 6 COP L D LUC S S L P DUS e Com e e sequence of Aci dovorax avenae subs citrulli C W nu C eek C US US DO oin Genome ns i u e 6 安徽農業(yè)科學 年