DB33/T 752-2009 植物種苗組培快繁技術規(guī)程.pdf

ICS 65 020 20 DB33 B05 備案號 浙江省地方標準 DB33 T 752 2009 植物種苗組培快繁技術規(guī)程 Technical regulations for plant micropropagation 2009 08 10 發(fā)布 2009 09 10 實施 浙江省質量技術監(jiān)督局 發(fā)布 DB33 T 752 2009 I 目 次 前 言 II 1 范圍 1 2 術語和定義 1 3 組培工廠的設計要求 所需的儀器設備及化學試劑 1 4 組培苗生產流程 2 5 培養(yǎng)容器和接種器械的清洗 2 6 培養(yǎng)基的配制 3 7 消毒滅菌操作 4 8 培養(yǎng)材料和外植體滅菌 4 9 接種操作 5 10 培養(yǎng)室操作 6 11 組培苗移栽和組培穴盤苗生產 7 12 質量標準 8 13 包裝 標志 運輸 8 附 錄 A 資料性附錄 常用植物組培術語和定義 9 附 錄 B 資料性附錄 植物組培苗生產流程圖 12 附 錄 C 資料性附錄 組培工廠設計 所需面積及設計要求 13 附 錄 D 資料性附錄 組培工廠所需的儀器設備 14 附 錄 E 資料性附錄 組培工廠所需的玻璃器皿及器材 16 附 錄 F 資料性附錄 常用基本培養(yǎng)基成分表 18 附 錄 G 資料性附錄 植物組培常用化學試劑 藥品一覽表 20 附 錄 H 資料性附錄 MS 培養(yǎng)基母液配配制表 23 附 錄 I 資料性附錄 常用植物生長物質的母液配制 24 DB33 T 752 2009 II 前 言 本標準的附錄A 附錄 B 附錄 C 附錄 D 附錄 E 附錄 F 附錄 G 附錄 H 附錄 I均為資料性附錄 本標準由浙江省農業(yè)廳提出并歸口 本標準起草單位 浙江省農業(yè)科學院 本標準主要起草人 陳劍平 徐剛 K B Kumar 汪一婷 呂永平 牟豪杰 DB33 T 752 2009 1 植物種苗組培快繁技術規(guī)程 1 范圍 本標準規(guī)定了植物種苗的組培快繁的術語和定義 組培工廠的設計要求 所需的儀器設備及化學試 劑 組培苗生產流程 培養(yǎng)容器和接種器械的清洗 培養(yǎng)基的配制 消毒滅菌 培養(yǎng)材料和外植體滅菌 接種操作 培養(yǎng)室操作 組培苗移栽和穴盤苗生產 質量標準及包裝 標志 運輸等內容 本標準適用于植物種苗的組培快繁技術規(guī)程管理的全過程 2 術語和定義 下列術語和定義適用于本標準 常用植物組培術語和定義參見附錄A 2 1 組培苗 plantlet 利用植物器官等作為外植體 采用植物組織培養(yǎng)技術生產的種苗 2 2 瓊脂苗 in agar plantlet 在培養(yǎng)容器中帶瓊脂的組培生根苗 2 3 無瓊脂苗 ex agar plantlet 從培養(yǎng)容器中取出并洗去瓊脂后的組培生根苗 2 4 組培穴盤苗 plug plant 移栽在穴盤中培育的組培生根苗 3 組培工廠的設計要求 所需的儀器設備及化學試劑 3 1 設計要求 3 1 1 組培工廠應建在排水設施良好 常年主風向的上風區(qū) 應遠離各種污染源 如粉塵大的工廠 微生物工廠和繁忙交通干道 周邊環(huán)境應干燥 安靜 通風透光 空氣清新 3 1 2 組培工廠新建建筑地基應高出地面 30 cm 以上 樓頂不應有滲漏 若建兩層或三層 宜安裝簡 單載物電梯 準備室 洗滌室 培養(yǎng)基配制室 滅菌室宜安排在樓下 接種室 培養(yǎng)室應防潮 隔熱保 溫 宜安排在二樓 三樓 3 1 3 組培工廠各分區(qū)要布局合理 應根據生產工藝流程 參見附錄 B 植物組培苗生產流程圖 把 各部分安排成一條連續(xù) 有序和通暢的生產流水線 3 1 4 利用辦公室 倉庫等舊房進行改造的組培工廠 應合理安排 做到杜絕污染 方便工作 節(jié)省 能源 使用安全 3 1 5 組培工廠設計包括組培車間 洗滌室 培養(yǎng)瓶晾干室 藥品室 稱量室 培養(yǎng)基配制室 滅 菌室 培養(yǎng)基儲存室 更衣室 接種室 培養(yǎng)室 出苗室和貯物室 辦公生活區(qū) 辦公室 工作人員室 和其它生活空間等 大棚溫室 母本圃 組培苗馴化區(qū) 組培苗移栽圃和輔助用房等 3 1 6 不同規(guī)模組培工廠設計 所需面積及設計要求參見附錄 C 3 2 儀器設備及化學試劑 DB33 T 752 2009 2 3 2 1 植物組培所需的儀器設備包括滅菌設備 培養(yǎng)設備和培養(yǎng)容器 實驗設備 辦公用品和消防滅 火設備等 不同規(guī)模組培工廠所需的儀器設備參見附錄 D 3 2 2 組培所需的玻璃器皿及器材包括盛裝器皿 燒杯 試劑瓶等 計量器皿 量筒 容量瓶等 以及其他常用消耗品等 不同規(guī)模組培工廠所需的玻璃器皿及器材參見附錄 E 3 2 3 常用化學試劑包括組培苗生產所用基本培養(yǎng)基所需的無機鹽類和有機物類 常用基本培養(yǎng)基成 分參見附錄 F 組培中常用的無機鹽類 有機物類 植物生長物質 消毒劑 洗滌劑等參見附錄 G 4 組培苗生產流程 4 1 生產流程圖 植物組培苗生產流程參見附錄B 4 2 新品種引進 母本圃種植 將引進的新品種植株種植在溫室內 加強肥水管理 確保植株健壯 防治病蟲害 減少植株表面附 帶的微生物和害蟲 4 3 材料選擇 從具有品種典型性狀的健康植株上選擇芽 莖或葉等植物材料作為外植體 4 4 外植體滅菌 參見8 3 外植體滅菌的方法將取得的外植體進行表面滅菌 4 5 初代培養(yǎng) 在無菌濾紙上將表面滅菌處理后的外植體切割成所需大小 一般約為0 5 cm 0 5 cm 0 5 cm 大小 接入初代培養(yǎng)基中進行培養(yǎng) 外植體初代培養(yǎng)20 d 40 d后 一般可誘導出幼芽 4 6 增殖培養(yǎng) 將初代培養(yǎng)誘導形成的幼芽或叢生芽 轉接到增殖培養(yǎng)基中進行培養(yǎng) 增殖培養(yǎng)周期根據培養(yǎng)材料 及組培苗生長情況而定 一般培養(yǎng)周期為30 d 60 d 增殖培養(yǎng)代數控制在16代 24代以內 繁殖系數 控制在2 5 4 0 4 7 壯苗培養(yǎng) 將增殖的叢生芽接種到壯苗培養(yǎng)基中 培養(yǎng)20 d 30 d 后幼苗株高可生長達2 cm 5 cm 4 8 生根培養(yǎng) 從壯苗培養(yǎng)的幼苗中切取生長健壯 葉色正常 葉片舒展 適于生根的無根苗 接種在生根培養(yǎng)基 中進行培養(yǎng) 培養(yǎng)20 d 30 d后幼苗基部長出數根新根 4 9 組培苗煉苗移栽 組培苗煉苗3 d 7 d后移入含蛭石 泥炭 珍珠巖等基質或混合基質的穴盤中 4 10 穴盤苗生產管理 穴盤苗在溫室大棚中進行光 溫 水 肥等管理 培育2 個月 3個月 穴盤苗可長至10 cm 15 cm 高 4 11 出苗 包裝 運輸 按本標準第13 章 包裝 標志 運輸的方法將瓊脂苗 無瓊脂苗和組培穴盤苗經包裝后出售 5 培養(yǎng)容器和接種器械的清洗 5 1 培養(yǎng)容器的清洗 5 1 1 浸泡 新的培養(yǎng)容器 培養(yǎng)瓶 培養(yǎng)皿和試管等 直接放入洗潔精或洗衣粉溶液中浸泡 用過 的培養(yǎng)容器須先倒掉瓶中的培養(yǎng)基后再浸泡 污染的培養(yǎng)容器應先按 7 1 的要求進行高壓滅菌 然后倒 掉瓶內污染物再浸泡 浸泡時間不應少于 6 小時 一般為過夜 5 1 2 洗刷 用瓶刷洗刷瓶內殘留的培養(yǎng)基和瓶外的灰塵 5 1 3 沖洗 將培養(yǎng)容器用自來水沖洗 3 遍 5 遍 DB33 T 752 2009 3 5 1 4 晾干 把沖洗干凈的培養(yǎng)容器倒放在培養(yǎng)容器專用框中晾干 5 1 5 清潔標準 晾干的培養(yǎng)容器內外壁無明顯的斑點 污跡 5 2 接種器械的洗刷 5 2 1 清理 清除接種器械 鑷子 解剖刀柄 不銹鋼碟等 上殘留的培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料 5 2 2 清洗 在洗潔精溶液中浸泡數分鐘 用鋼絲球洗刷后用清水沖洗 3 遍 5 遍 5 2 3 滅菌 用棉布或紙等包好接種器械 按 7 1 進行高壓滅菌 5 2 4 玻璃器皿應小心輕放 避免打碎劃破手 移取燙手的器械時應戴隔熱手套 如棉手套或石棉防 火手套 若發(fā)生意外參見相關實驗室安全規(guī)程處理 6 培養(yǎng)基的配制 6 1 培養(yǎng)基選擇 根據培養(yǎng)材料生長發(fā)育特性選擇合適的基本培養(yǎng)基種類和激素配比 常見基本培養(yǎng)基成分參見附錄 F 6 2 化學試劑的選擇和保存 6 2 1 應符合附錄 G 所要求的試劑級別 6 2 2 應標簽完整 并在有效期內使用 6 2 3 每瓶試劑在使用前目測應無異物異色 6 2 4 應嚴格按規(guī)定的溫度存放 6 3 基本培養(yǎng)基母液的配制和保存 6 3 1 制作培養(yǎng)基前需先配制基本培養(yǎng)基母液 MS 基本培養(yǎng)基母液配制比例參見附錄 H 其它基本培 養(yǎng)基母液配制比例可參考本方法 6 3 2 母液配制應用去離子水 6 3 3 母液保存要求 母液保存應置于 4 左右的冰箱內 母液保存期應不超過 15 天 6 3 4 母液容器上應貼好標簽 注明名稱 配制日期 發(fā)現(xiàn)標簽不明或母液中有沉淀 渾濁或變色現(xiàn) 象應停止使用 6 4 植物生長物質的母液配制 6 4 1 植物生長物質的母液配制濃度 0 1 mg mL 1 0 mg mL 植物生長物質的母液配制方法參見附錄 I 6 4 2 植物生長物質的母液保存要求 母液配制好后貼好標簽 按規(guī)定要求保存 保存期應不超過 2 個月 6 5 培養(yǎng)基制作 6 5 1 準備 根據培養(yǎng)基成分準備好去離子水 瓊脂 蔗糖和各類母液等 6 5 2 瓊脂融化 加去離子水 700 mL 按所需容量的 70 左右 再加入瓊脂 5 g 9 g 加熱攪拌使 瓊脂融化 6 5 3 糖溶解 瓊脂融化后 加入蔗糖 30 g 稍加熱使糖溶解 6 5 4 加母液 糖溶解后 按附錄 F 吸取母液 即依次加入 A 大量元素 50 mL L B 鐵鹽 10 mL L C 微量元素 5 mL L D 有機成分 5 mL L E 有機成分 10 mL L 再根據要求加入激素 不耐高溫的激 素 應在培養(yǎng)基高壓滅菌后再過濾滅菌加入 若干 并充分攪拌 6 5 5 定容 攪拌均勻后 加去離子水至 1 升 6 5 6 pH 值測定 充分攪拌后 用 pH 計或 pH 試紙測 pH 值 用 0 1 mol L 的 HCl 或 0 1 mol L 的 NaOH 調節(jié) pH 至要求值 一般為 5 8 6 5 7 分裝 根據不同需要定量分裝 如 250 mL 的培養(yǎng)瓶 每升分裝 25 瓶 30 瓶 每瓶分裝約 33mL 40 mL 分裝培養(yǎng)基時勿將培養(yǎng)基沾在培養(yǎng)瓶瓶口 6 5 8 封口 蓋好瓶蓋 或用封口膜封口 扎繩需緊 DB33 T 752 2009 4 6 5 9 滅菌 分裝后應按照 7 1 的要求 在 10 h 內進行高壓滅菌 6 5 10 冷卻 滅菌后的培養(yǎng)基應冷卻 待完全凝固后再用 6 5 11 貯存 滅菌后的培養(yǎng)基應注明培養(yǎng)基編號及配制日期 按培養(yǎng)基種類和配制先后分門別類儲存 于培養(yǎng)基儲藏室內 為保證培養(yǎng)基質量 宜將配制好的培養(yǎng)基放置 5 天左右再用 且貯存時間不應超過 一個月 注 6 5 1 6 5 11為配制1升 MS培養(yǎng)基的方法 配制其它不同容量MS培養(yǎng)基的方法可參考本方法 7 消毒滅菌操作 7 1 濕熱滅菌 7 1 1 組培中主要采用高壓蒸汽滅菌器進行濕熱滅菌 高壓滅菌器適用于培養(yǎng)基 不耐高溫的成分除 外 無菌水 玻璃器皿 金屬器械等 以及污染瓶的滅菌處理 7 1 2 應嚴格按使用說明書操作各種類型的高壓滅菌器 7 1 3 滅菌要求 一般 1 1 kg cm 2 1 2 kg cm 2 下 121 滅菌 20 min 30 min 7 1 4 已滅菌的培養(yǎng)瓶或物品不得與未滅菌培養(yǎng)瓶或物品混放 合格的滅菌培養(yǎng)瓶或物品 應注明滅 菌日期 合格標志 7 2 干熱滅菌 7 2 1 玻璃器皿及耐熱器械應采用干熱滅菌 7 2 2 干熱滅菌利用烘箱加熱到 160 180 的溫度來殺死微生物 通常 170 持續(xù) 90 min 進行 滅菌 7 3 過濾滅菌 7 3 1 不耐熱的物質需采用過濾滅菌 一些植物激素 如赤霉素 玉米素 脫落酸等 和一些抗生素 類通常采用過濾滅菌方法 7 3 2 過濾滅菌采用濾膜網孔直徑為 0 45 m 以下的微孔過濾滅菌器 7 4 灼燒滅菌 7 4 1 用于無菌操作的器械采用灼燒滅菌 7 4 2 灼燒滅菌可采用接種用電熱滅菌器或用酒精燈灼燒滅菌 7 5 擦拭 噴霧滅菌 7 5 1 物體表面可用一些藥劑涂擦 噴霧滅菌 如桌面 墻面 雙手 植物材料表面等 7 5 2 擦拭 噴霧滅菌可用 75 的酒精或 0 1 的新潔爾滅菌 7 6 紫外線滅菌 7 6 1 在接種室 培養(yǎng)室等房間定期用紫外燈滅菌 7 6 2 紫外燈滅菌一般為 30 min 7 7 熏蒸滅菌 7 7 1 接種室和培養(yǎng)室定期 一般 1 年 1 次 2 次 用高錳酸鉀及甲醛混合熏蒸 7 7 2 熏蒸時 房間關閉緊密 用甲醛 10 mL m 和高錳酸鉀 KMnO 4 5 g m 熏蒸 2 d 3 d 通風無味后 一般需 2 d 3 d 人員方可進入 7 8 表面滅菌 組培中的外植體需進行表面滅菌 參見第8 章 8 培養(yǎng)材料和外植體滅菌 8 1 培養(yǎng)材料的選擇 從具有品種典型性狀的健康植株上選擇芽 莖或 種子 鱗莖 花梗 根等植物材料作為外植體 8 2 外植體的采集時間 于晴天或露水干后采集外植體 DB33 T 752 2009 5 8 3 外植體滅菌 8 3 1 無菌水的準備 將自來水加入有蓋的培養(yǎng)瓶中 按 7 1 的要求進行高壓滅菌 8 3 2 材料預處理 種子預先浸種 0 5 h 至數小時 植物材料除去老葉 剪取所需幼芽莖段 2 cm 3 cm 長 葉片 適當大小 花梗 約 5 cm 長 鱗莖 根 約 5 cm 長 等 整理好的外植體 用中性 洗衣粉加少許吐溫浸泡并振蕩 5 min 10 min 自來水沖洗 30 min 60 min 8 3 3 在超凈臺上將預處理后的外植體放在有蓋容器中 倒入 75 酒精使之沒過外植體 并輕搖以除 去氣泡 經過 10 s 50 s 將酒精傾去 用無菌水沖洗外植體 3 遍 8 3 4 芽 莖段 葉片及花梗等的滅菌 用 0 5 2 0 的次氯酸鈉溶液浸泡 10 min 15 min 處理過 程中要不斷輕搖 將外植體表面的氣泡除去 滅菌結束后 倒出滅菌液 用無菌水沖洗 3 遍 5 遍后備 用 8 3 5 根 鱗莖等的滅菌 用 1 0 2 0 的次氯酸鈉溶液浸泡 10 min 15 min 處理過程中要不斷輕 搖 將外植體表面的氣泡除去 滅菌結束后 倒出滅菌液 用無菌水沖洗 3 遍 5 遍后備用 8 3 6 果實和種子的滅菌 果實用 1 0 2 0 的次氯酸鈉溶液浸泡 15 min 無菌水沖洗 2 遍 3 遍后 接種果實內的種子或組織 種子用 1 0 2 0 的次氯酸鈉溶液浸泡 20 min 30 min 處理過程中要不 斷輕搖 將外植體表面的氣泡除去 滅菌結束后 倒出滅菌液 用無菌水沖洗 3 遍 5 遍后備用 8 4 升汞的配制和安全使用 8 4 1 使用條件 配備專用的有害液體處理池的單位可使用升汞進行外植體的表面滅菌處理 8 4 2 升汞溶液的配制濃度和保存 升汞溶液的配制濃度為 0 1 溶液裝在棕色玻璃瓶中貯存 8 4 3 滅菌時間 0 1 升汞溶液滅菌 10 min 15 min 8 4 4 安全管理方法 升汞安全管理方法參見 浙江省醫(yī)療用毒性藥品經營管理辦法 試行 9 接種操作 9 1 操作準備 9 1 1 接種人員應在更衣室更換拖鞋 穿白大褂 或接種服 戴上帽 口罩后進入接種室 或經過 風淋室后進入接種室 9 1 2 接種人員在接種之前應準備酒精燈或電熱滅菌器 酒精或新潔爾滅 無菌脫脂棉或紗布以及接 種器械 培養(yǎng)基 接種用苗等 9 1 3 超凈工作臺 或潔凈無菌接種室 提前 30 min 開機通風 同時打開操作間 更衣間及緩沖間的 紫外燈 一般滅殺菌 30 min 后 關掉紫外燈 關紫外線燈 15 min 20 min 后人員才可進入室內 9 1 4 超凈工作臺消毒 用 75 酒精或 0 1 新潔爾滅仔細擦一遍 9 1 5 提前 15 min 打開接種用電熱滅菌器 9 1 6 操作人員洗手后 用 75 酒精噴手于操作臺內吹干 勿雙手互擦 9 2 提取母瓶 9 2 1 母瓶檢查 提取母瓶時要仔細檢查母瓶是否污染 若發(fā)現(xiàn)污染母瓶應立即剔除 9 2 2 母瓶預處理 按生產計劃提取母瓶 表面噴 75 的酒精后 用無菌紗布擦凈 放于操作臺旁備 用 接種過程中若發(fā)現(xiàn)母瓶污染則立即封口 9 2 3 污染母瓶處理 把污染母瓶放于統(tǒng)一地點供集中處理 9 3 切割碟子的取放 用無菌鑷子從棉布包里取出碟子放在超凈工作臺面上 應注意手不能接觸碟子的邊沿 9 4 接種器械滅菌 9 4 1 接種前接種器械用棉布或紙包好按 7 1 的要求進行高壓滅菌 9 4 2 接種時若使用酒精燈滅菌 從布包里取出接種器械 先用 75 酒精擦拭 再放在酒精燈外焰上 灼烤一遍 要求接種器械在火焰上灼烤時間在 10 s 以上 DB33 T 752 2009 6 9 4 3 若使用接種用電熱滅菌器 從布包里取出接種器械 先用 75 酒精擦拭 再插入接種用電熱滅 菌器中進行滅菌 150 250 滅菌 30 s 以上 9 5 接種 9 5 1 在接種之前 工作人員的手部 包括手腕 都要用 75 的酒精仔細擦拭一遍 9 5 2 接種器械按 9 4 2 或 9 4 3 方法滅菌后 在器具擱置架上晾放 2 min 以上備用 9 5 3 取苗 先打開培養(yǎng)瓶蓋 瓶口不要斜向外 取出的苗放于無菌的碟子上分苗 一次取苗不宜太 多 以免風干 9 5 4 切苗 碟子放在離風窗 10 cm 20 cm 處 在操作過程中 手術刀和鑷子都要在無菌碟子斜上方 操作 不應在其正上方操作 切苗過程中產生的廢棄物可堆放在無菌的碟子內的一側 不應散到碟子外 9 5 5 接苗 打開培養(yǎng)瓶蓋 瓶蓋朝下放置在無菌的碟子上 碟子應經常用 75 酒精紗布涂抹滅菌 接苗時 鑷子不應碰到培養(yǎng)瓶外壁或瓶口 9 5 6 一瓶內一般不宜接種得太多 數量因種而異 250 mL 的培養(yǎng)瓶的一般增殖培養(yǎng)接種數量為 5 株 瓶或 5 團 瓶 生根培養(yǎng)接種數量為 10 株 瓶 9 5 7 組培苗在瓶內要排放均勻 整齊 接種深度以組培苗不倒為準 9 5 8 接種器械清洗和滅菌 切割和接種后 接種器械在盛有 75 酒精的瓶中將接種器械上的瓊脂和 碎葉或碎根漂洗掉 或接種器械用 75 酒精浸濕的紗布擦凈 按 9 4 2 或 9 4 3 方法滅菌后晾放備用 9 6 封口 及時蓋上瓶蓋 其松緊度以用手轉不動為準 9 7 記錄 接種人員將品種代號 培養(yǎng)基類型 個人編號以及接種日期認真標示到瓶上 逐日統(tǒng)計本人的接種 數量 包括接種前瓶數和接種后瓶數 字跡工整 9 8 送苗 接種完畢 把瓶苗送到培養(yǎng)室 宜整齊擺放在指定的組培架上 9 9 關機 離開之前應熄滅酒精燈或關閉電熱滅菌器 把超凈工作臺收拾干凈 清理接種過程中產生的空瓶 垃圾及雜物 擦拭操作臺面 并用75 酒精噴灑臺面 臺上的物品也宜擺放整齊 最后關閉超凈工作 臺及電源 9 10 組培接種人員的注意事項 9 10 1 操作人員應注意個人整潔 勤剪指甲 操作時頭 胳膊等不應進入超凈工作臺內 9 10 2 操作時不應隨意談話 說笑 以減少污染 9 10 3 工作人員出入應隨手關門 9 10 4 工作過程中所產生的垃圾應及時清理 9 11 接種操作的安全管理 鑷子 解剖刀 手術剪等接種器械的滅菌采用酒精擦拭或浸泡后在酒精燈上燒烤的方法進行 接種 器械燒烤時應遠離盛酒精的容器 不應燒烤后立即插入盛酒精的容器中 也應避免碰倒酒精容器或酒精 燈后引起失火 在酒精燈點燃后 不可用酒精溶液噴灑超凈工作臺 萬一失火 應立刻關閉電源 用濕 布撲滅 若火勢較大 用滅火器撲滅 10 培養(yǎng)室操作 10 1 培養(yǎng)室培養(yǎng)條件調控 培養(yǎng)室的溫度一般控制在 25 2 相對濕度70 80 光照強度18 75 mol m 2 s 1 37 5 mol m 2 s 1 1 500 lx 3 000 lx 以每天 12 h 16 h 為宜 每天早上 中午 下午各檢查一次并做好記 錄 10 2 瓶苗擺放 DB33 T 752 2009 7 培養(yǎng)室內 瓶苗宜擺放整齊 品種應分明 10 3 污染檢查 10 3 1 接種材料污染采取培養(yǎng)室管理員和接種員雙重鑒別制 各自做好記錄 10 3 2 所有污染材料不應在培養(yǎng)室 接種室及中央走廊內開啟瓶蓋 10 3 3 所有污染材料 包括真菌和細菌污染 應在發(fā)現(xiàn)當天送到洗滌室 10 3 4 對細菌污染的生根瓶苗可轉移到練苗室移栽 10 3 5 對處理情況進行數據記錄和簡要分析原因 并反饋給操作人員 10 4 工作人員注意事項 10 4 1 進入培養(yǎng)室應穿工作服 包括更換拖鞋 穿白大褂 10 4 2 在培養(yǎng)室內保持安靜 10 4 3 進出培養(yǎng)室時應及時關門 10 4 4 各種生產用品要按固定的位置排放整齊 10 4 5 工作過程中所產生的垃圾應及時清理 10 4 6 培養(yǎng)室內出苗 進苗后 應及時整理 保持室內清潔 每天用自來水拖 1 次 2 次地面 10 4 7 設備維護 維護各種生產設備的正常使用 不正常應及時告知后勤保障部進行處理 10 5 培養(yǎng)室內清潔 消毒 10 5 1 每周用 75 的酒精溶液作噴霧降塵處理 10 5 2 每周用消毒液 0 1 新潔爾滅 抹地板 門窗等 10 5 3 每隔一周用紫外燈或臭氧發(fā)生器消毒 30 min 10 5 4 如培養(yǎng)室有通風裝置 如安裝有換氣扇等 的可用甲醛熏蒸 每年 1 次 2 次 10 5 5 每月用殺螨劑 克螨特 阿維菌素 殺蟲劑 吡蟲啉 艾克敵 殺螞蟻藥等藥劑噴霧一次 10 5 6 定期檢查培養(yǎng)室內漏雨及墻壁長霉情況 發(fā)現(xiàn)有霉菌時應及時去除 并用防菌涂料粉刷墻壁 10 5 7 按 10 5 1 10 5 2 方法處理時培養(yǎng)室內可以保留培養(yǎng)材料 按 10 5 3 10 5 4 10 5 5 10 5 6 方法處理時培養(yǎng)室內應清空培養(yǎng)材料 進行空室處理 11 組培苗移栽和組培穴盤苗生產 11 1 練苗 11 1 1 移栽標準 一般生根培養(yǎng) 20 d 30 d 后 幼苗基部長出 3 條以上 長 1 cm 3 cm 的新根 11 1 2 在移栽前將培養(yǎng)瓶放置溫室自然散射光下 溫度控制在 25 3 封口煉苗 3 d 7 d 11 2 移栽 11 2 1 出瓶 用手指或鑷子輕輕取出組培苗 放入清水內 注意水溫勿相差大 冬季水溫應調整為 20 25 洗去瓊脂 分級待移栽 11 2 2 配制混合基質 配制混合基質泥碳土 珍珠巖 蛭石按一定比例混配好 一般比例為 3 1 1 宜根據不同植物加以適當調整 裝入穴盤中并壓緊 定植前用 0 5 g L 的多菌靈溶液浸透 11 2 3 定植 用竹簽等工具在每穴上打能容納根系的孔 將組培苗的根系放入孔內 覆土壓實 11 2 4 擺放 分品種 日期 歸類整齊擺放 11 3 管理 11 3 1 溫度 根據植物生長習性確定移栽時的控制溫度 適宜溫度為 15 28 11 3 2 相對濕度 移栽 2 周 3 周內用薄膜小拱棚保濕 相對濕度控制在 80 100 在大棚相對 濕度高于 80 期性時 薄膜小拱棚可適時通風 0 5 h 1 h 當第一片新葉完全張開后 逐漸打開薄膜小 拱棚以降低濕度 8 周 10 周后完全打開薄膜小拱棚 大棚相對濕度保持在 60 以上 11 3 3 光照 移栽 4 周內 薄膜拱棚內的光照強度控制在 90 mol m 2 s 1 180 mol m 2 s 1 5 000 lx 10 000 lx 4 周后逐漸增大光照強度 11 3 4 澆水 4 周后可用噴淋澆水 DB33 T 752 2009 8 11 3 5 施肥 移栽第 4 周 8 周 每周噴施液肥一次 N P K 20 10 20 和 N P K 14 0 14 交替使用 濃度為 1 500 倍 移栽 8 周后 視植株生長情況 濃度逐漸增加 11 3 6 噴藥 移栽 4 周后 每周噴施百菌清或多菌靈等殺菌劑一次 濃度分別為 1500 倍 1000 倍 移栽第 8 周 追施克線磷等殺線蟲藥 12 質量標準 12 1 組培苗的質量標準 12 1 1 整體感 苗有活力 粗壯 挺直 葉片大小協(xié)調 有層次感 色澤正常 葉色具原品種特性 無玻璃化 12 1 2 根系狀況 有新鮮根系 一般 3 條以上 長勢好 色白健壯 根長適中 基本無愈傷組織 12 1 3 苗高 苗高適中 一般 3 cm 5 cm 12 1 4 葉片數 具有適宜和正常的葉片數 一般不少于 3 片 12 1 5 整齊度 同一批次 90 以上的苗高達到要求的高度 12 1 6 培養(yǎng)基污染狀況 無污染 12 2 組培穴盤苗的質量標準 12 2 1 整體感 苗健壯 挺拔和新鮮 形態(tài)完整 葉片大小協(xié)調 葉色具原品種特性 有光澤 12 2 2 根系狀況 應具有完整而發(fā)達的根系 根系充滿穴盤孔 能輕易拔出而基質不散 12 2 3 苗高 苗矮壯墩實 一般 8 cm 12 cm 12 2 4 葉片數 具有較多的葉片數 一般 8 片以上 12 2 5 整齊度 同一批次 90 以上的苗高達到要求的高度 12 2 6 病蟲害損傷 無檢疫性病蟲害 亦無病蟲害危害斑點 13 包裝 標志 運輸 13 1 包裝 13 1 1 瓊脂苗包裝 瓊脂苗仍保留在培養(yǎng)瓶中 培養(yǎng)瓶放在泡沫箱里 箱外再用紙箱包裝 運輸時應 使用紙托盤 13 1 2 無瓊脂苗包裝 生根組培苗洗去瓊脂后 先裝入小塑料盒 再放在泡沫箱里 箱外再用紙箱包 裝 運輸時一般不用托盤 13 1 3 穴盤苗包裝 穴盆裝在小紙箱內 再將小紙箱裝入大紙箱內 每箱裝 3 張 4 張穴盤 運輸時 宜使用紙托盤 13 2 標志 每箱應貼上標簽 注明品種 等級 規(guī)格 數量 產地 出苗日期等 13 3 運輸 裝車時切勿倒置 用有蓬車輛運輸以避免日曬 雨淋 高溫和嚴寒季節(jié)選用有冷藏車 運輸途中溫 度保持10 15 5 d內到達目的地 DB33 T 752 2009 9 附 錄 A 資料性附錄 常用植物組培術語和定義 A 1 植物組培 plant tiss ue culture 植物組織培養(yǎng)的簡稱 在無菌條件下 將離體的植物器官 如根 莖 葉 花 果實 種子等 組織 如形成層 胚乳 皮層等 細胞 體細胞和生殖細胞 或原生質體等 培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng) 基上 在一定的光照和溫度條件下 使之生長 分化并發(fā)育成完整小植株的培養(yǎng)技術 A 2 組培工廠 plant tis sue culture production center 采用植物組織培養(yǎng)技術 生產植物組培苗的工廠 A 3 外植體 explant 用于無菌培養(yǎng)的植物活體 包括完整植株 胚胎或從植物體上切取的器官 組織等一切材料 A 4 培養(yǎng)材料 culture material 生長在培養(yǎng)容器內培養(yǎng)基中的植物材料 A 5 植物生長物質 plant growt h substance 調節(jié)植物生長發(fā)育的物質 包括植物激素和植物生長調節(jié)劑 A 6 培養(yǎng)基 culture medium 在植物組織培養(yǎng)過程中 由人工配制的提供培養(yǎng)材料生長所必需的營養(yǎng)元素和某些植物生長物質的 基質 A 7 接種 inoculation 將滅菌后的外植體或培養(yǎng)材料在無菌條件下接入培養(yǎng)容器內培養(yǎng)基中的過程 A 8 初代培養(yǎng) primary culture 將滅菌后的外植體接種在無菌培養(yǎng)基中進行的第一代培養(yǎng) A 9 誘導培養(yǎng) induction culture 將滅菌后的外植體或培養(yǎng)材料接種到誘導愈傷組織等器官培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的過程 DB33 T 752 2009 10 A 10 繼代培養(yǎng) subculture 培養(yǎng)過程中將培養(yǎng)材料周期性地分株 分割 剪截等操作后轉接入新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)的過程 A 11 增殖培養(yǎng) multiplication 繼代培養(yǎng)材料產生出不定芽或新的組培苗的過程 A 12 培養(yǎng)代數 number of subculture 同一培養(yǎng)材料經繼代培養(yǎng)的次數 A 13 繁殖系數 propagation coefficient 一個培養(yǎng)周期內不定芽增殖倍數 即培養(yǎng)一個周期后增殖的不定芽數 接種時的不定芽數 A 14 壯苗培養(yǎng) 將增殖的叢芽接種到壯苗培養(yǎng)基中進行培養(yǎng) 使幼苗長高長粗 A 15 生根培養(yǎng) root induction 把不定芽轉移到生根誘導培養(yǎng)基中誘導生根 形成完整植株的過程 A 16 生根率 rooting rate 培養(yǎng)容器內生根的不定芽數占接種不定芽數的百分比 A 17 瓶苗 in vitro plantlet 在培養(yǎng)容器中生長且已達移栽標準的根 莖 葉俱全的完整植株 A 18 移栽 transplanting 組培苗在培養(yǎng)瓶中長出一定數量的根或根原基后 從瓶中取出移植到基質中的過程 A 19 愈傷組織 callus 外植體在離體培養(yǎng)條件下 細胞經脫分化等一系列過程 改變了它們原有的生長特性而轉變成一種 能迅速增殖的無特定結構和功能的細胞團 A 20 玻璃化 vitrification DB33 T 752 2009 11 植物組織培養(yǎng)過程中所特有的一種生理失調和生理病變 表現(xiàn)為組培苗生長異常 幼葉和嫩梢呈半 透明 水浸狀 整株矮小腫脹 失綠 葉片皺縮卷曲 脆弱易斷 A 21 褐變 browning 在離體培養(yǎng)中 由于培養(yǎng)組織中的多酚氧化酶被激活 使細胞的代謝發(fā)生變化 酚類物質被氧化成 棕褐色的醌類物質 使培養(yǎng)物及培養(yǎng)基變成褐色的現(xiàn)象 A 22 組培室 plant tissue culture room 進行植物組織培養(yǎng)技術研究和組培苗生產的場所 包括洗滌室 培養(yǎng)基配制室 滅菌室 接種室和 培養(yǎng)室等部分 A 23 洗滌室 washing room 洗滌各種玻璃器皿 培養(yǎng)瓶 試管和各種用具以及進行植物材料預處理的場所 A 24 培養(yǎng)基配制室 medium pr eparation room 配制化學試劑 培養(yǎng)基母液 培養(yǎng)基以及分裝培養(yǎng)基和制備純水和蒸餾水等的場所 A 25 滅菌室 sterilization room 進行培養(yǎng)基 無菌水和器械等高壓滅菌的場所 A 26 接種室 inoculation room 接種室也稱無菌操作室 是外植體的滅菌 培養(yǎng)材料的接種 轉移 繼代增殖 生根等無菌操作以 及進行過濾滅菌和分裝過濾滅菌培養(yǎng)基等工作的場所 A 27 培養(yǎng)室 growth room 培養(yǎng)材料和組培苗在人工控制溫度 相對濕度和光照等條件下培養(yǎng)和生長的場所 DB33 T 752 2009 12 附 錄 B 資料性附錄 植物組培苗生產流程圖 植物組培苗生產流程圖見圖B 1 圖 B 1 植物組培苗生產流程圖 DB33 T 752 2009 13 附 錄 C 資料性附錄 組培工廠設計 所需面積及設計要求 組培工廠設計 所需面積及設計要求見表C 1 表 C 1 組培工廠設計 所需面積及設計要求 廠區(qū)布局 年產 50 萬株 年產 100 萬株 年產 200 萬株 設計要求 說明 面積m 2 面積m 2 面積m 2 組培車間 200 370 700 自動檢測和噴淋的消防系統(tǒng) 洗滌室 15 20 40 通風 干燥 室內要有上 下水設施 地面防潮防滑并便于清洗 內做大水槽若干 培養(yǎng)瓶晾干室 5 20 40 通風 干燥 整潔 內裝空調和通風裝置 藥品室 稱量室 20 20 20 清潔干燥通風 能終年保持相對較低的溫度 避免陽光直照 放 置天平的實驗臺要平整穩(wěn)固 培養(yǎng)基配制室 15 20 40 通風 干燥 配備大容量用電專用線路 上下水道暢通 培養(yǎng)基滅菌室 5 20 20 地面與墻壁必須能夠忍受高濕狀態(tài) 地面防滑 白瓷磚墻面 配 備大容量用電線路等 培養(yǎng)基儲存室 10 20 40 低溫 干燥 整潔 避免光照 潔凈度要高 配置空調 通風裝 置 紫外燈等 更衣室 10 10 20 通風 干燥 整潔 避免光照 緊連接種室 配置衣柜 鞋柜 洗手盆等 接種室 無菌操作室 20 50 100 控溫 25 2 控濕 相對濕度 75 以下 干凈 整齊 通 風 光線好 內墻白色光滑 配置空調 超凈工作臺等 培養(yǎng)室 60 150 300 控溫 25 2 控濕 相對濕度 70 75 干凈 整潔 光 線好 內墻白色光滑 配置空調 通風裝置 日光燈 培養(yǎng)架 自動控光設備等 潔凈度要高 由于燈管數量較多 設計時應考 慮用電負荷 設置專線和配電設備 出苗室 20 20 40 控溫 干凈 通風 光線好 內墻白色光滑 上下水道暢通 貯物室 20 20 40 通風 干燥 貯存組培用的洗滌用品等低值品耗 以及存放無菌 水 酒精等物品 溫室或大棚 750 1500 3000 母本圃 50 100 100 控溫 控濕 控光 防蟲 能采用自然光照 組培苗馴化區(qū) 25 50 50 控溫 控濕 控光 防蟲 適當遮陽 組培苗移栽圃 650 1300 2700 控溫 控濕 控光 防蟲 能采用自然光照 輔助用房 50 100 200 包括控制間 物料間 包裝間等 辦公生活區(qū) 60 120 200 辦公室 20 40 80 辦公桌 電話 傳真機 電腦 打印機等辦公設備 工作人員室 20 40 80 洗手盆 急救箱 儲物柜等 可加裝飲水機 冰箱 微波爐 休 息臺凳等 其它生活空間 20 40 40 包括洗手間 樓道等 DB33 T 752 2009 14 附 錄 D 資料性附錄 組培工廠所需的儀器設備 組培工廠所需的儀器設備見表D 1 表 D 1 主要設備及用途說明 儀器設備名稱 年產 50 萬株 年產 100 萬株 年產 200 萬株 規(guī)格型號 用途說明 數量 數量 數量 滅菌設備 器械 立式高壓滅菌器 1 1 1 50 升 3 5KW 全不銹鋼外形 自動控溫 控壓 定時 自動斷電功能 最高工作 壓力 0 165Mpa 最高工作溫度 126 培養(yǎng)基滅菌 臥式高壓蒸汽 滅菌器 0 1 2 360 升 不銹鋼內壁 電加熱單門或雙扉 溫度自控 培養(yǎng)基滅菌 電熱干燥箱 1 1 1 220V 250 1 4 5kw 工作室尺寸 50cm 60 75cm 玻璃器皿干燥 紫外燈 若干 若干 若干 30W 40W 日光燈通用 房間消毒 臭氧機 1 2 2 房間消毒 微孔濾器 若干 若干 若干 0 22 m 0 45 m 25mm 帶注射器 可高壓滅菌封裝 過濾不能高溫滅菌的試劑 用 接種設備及器械 超凈工作臺 8 16 32 雙人或單人 水平送風或垂直送風 潔凈度百級 送風風速 0 4 0 6m s 組培接種用 接種器具電熱殺菌 器 8 16 32 全不銹鋼 電加熱 溫度可調 自動控 溫 數字顯示 代替酒精燈 接種器具殺菌 石英玻璃珠 若干 若干 若干 2 2 5mm 接種器具殺菌器專用 槍狀鑷子 16 32 64 25cm 不銹鋼 接種用 手術刀柄 16 32 64 3 12CM 不銹鋼 接種用 10 刀片 若干 若干 若干 圓頭 10 片 包 接種用 11 刀片 若干 若干 若干 尖頭 10 片 包 接種用 剪刀 8 16 32 各式 不銹鋼 接種用 器具擱置架 8 16 32 不銹鋼 接種用 切割碟子 800 1600 3200 不銹鋼 14cm 接種用 培養(yǎng)設備和培養(yǎng)容器 光照培養(yǎng)箱 1 2 2 205L 強光 暗 5 50 光 10 50 溫度波動 1 5 組培試驗用 調速振蕩器 1 1 1 1000mm 800mm 垂直或水平旋轉 組培培養(yǎng)用 空調 5 10 20 KFR 45GW C 培養(yǎng)室控溫 培養(yǎng)架 包括日光燈 100 200 400 噴塑角鋼 135mm 50mm 180mm 5 層 層高 30cm 每層 2 支日光燈 放置培養(yǎng)瓶 晾瓶架 5 10 10 噴塑角鋼 135mm 50mm 180mm 5 層 用于晾瓶室的培養(yǎng)瓶存放 組培專用托盤 1500 3000 6000 62 49 4 5 可高溫滅菌 鏤 空槽 放置培養(yǎng)瓶 培養(yǎng)瓶 6 萬 12 萬 24 萬 250mL 材質 耐高溫玻璃或塑料 組培用瓶 試管 1000 2000 3000 一般選用 2 0cm 15cm 和 3 0cm 20cm 材質 耐高溫玻璃或塑料 初代培養(yǎng)用 DB33 T 752 2009 15 表 D 1 續(xù) 儀器設備名稱 年產 50 萬株 年產 100 萬株 年產 200 萬株 規(guī)格型號 用途說明 實驗設備 電子分析天平 1 1 1 0 1mg 0 210g 自動內校 稱微量元素等 電子精密天平 1 1 1 0 01