赤霉素高產(chǎn)菌株篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化.pdf

北 方 園 藝 研究簡報 第一作者簡介 李春玲 女 本科 助理研究員 現(xiàn) 主要從事微生物發(fā)酵菌種選育等研究工作 責(zé)任作者 張萍 女 本科 工程師 現(xiàn)主要從事微 生物發(fā)酵等研究工作 收稿日期 赤霉素高產(chǎn)菌株篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化 李 春 玲 牛 春 張 萍 寧夏泰瑞制藥股份有限公司 寧夏 銀川 摘 要 以 株產(chǎn)赤霉素的藤倉赤霉菌 為出發(fā)菌株 對其脂肪 酶活性 制霉素抗性 固態(tài)發(fā)酵效率進(jìn)行了比較分析 以期選育出赤霉素發(fā)酵生產(chǎn)的優(yōu)良菌 株 結(jié)果表明 篩選出 株遺傳穩(wěn)定性好 生產(chǎn)效率高的菌株 其 發(fā)酵效價分別為 干基 該研究結(jié)果對赤霉素固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的實現(xiàn)具 有重要意義 關(guān)鍵詞 赤霉素 發(fā)酵菌株 藤倉赤霉菌 固態(tài)發(fā)酵 發(fā)酵條件 中圖分類號 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 文章編號 赤霉素 簡稱 是一種廣泛 存在的植物激素 為四環(huán)二萜類化合物 研究者已 鑒定出 類化合物有 多種 其中 具有較強(qiáng)的生物活性 被開發(fā)成 多種植物生長調(diào)節(jié)劑 廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè) 林業(yè)等生 產(chǎn)領(lǐng)域 市場前景十分廣闊 生產(chǎn)方式主 要包括植物提取法 化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法 種方法 植物提取法是指從植物組織中分離提 純 由于植物組織中 含量極低 致使該方 法成本很高 生產(chǎn)效率很低 化學(xué)合成法是指采用 系列化學(xué)反應(yīng)生成 該方法過程復(fù)雜 成本高 且易造成環(huán)境污染 微生物發(fā)酵法是通過微生物 細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn) 該方法具有周期短 效率高等 優(yōu)點 是工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn) 通用的方法 目前用于發(fā)酵生產(chǎn) 的微生物主要是藤 倉赤霉菌 藤倉赤霉菌產(chǎn) 能力是發(fā)酵生產(chǎn)最關(guān)鍵的因素 等 等 等 通過誘變的方 法 選育出系列高產(chǎn)的藤倉赤霉菌菌株 世紀(jì) 年代 國內(nèi) 發(fā)酵生產(chǎn)的開創(chuàng)者 九二零菌 種選育協(xié)作組 篩選出高產(chǎn)變種 成為當(dāng)時 國內(nèi)工業(yè)化生產(chǎn)上主要菌株 余卿等 利用原 生質(zhì)體紫外誘變技術(shù)獲得高產(chǎn)菌株 其產(chǎn)量提高 近 李武軍等 利用融合重組誘變技術(shù)將菌 株產(chǎn)量提高了近 張金兒等 王衛(wèi)等 對 藤倉赤霉菌也進(jìn)行了篩選研究 并獲得了較理想 的結(jié)果 合適的發(fā)酵條件是發(fā)酵生產(chǎn)的保障 當(dāng) 前 生產(chǎn)多采用液體發(fā)酵法 但該法存在濃縮 工藝復(fù) 雜 成 本 高 等 局 限 嚴(yán)重制約其擴(kuò)大生 產(chǎn) 近年來的研究表明 固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn) 較液態(tài)發(fā)酵效率更高 且成本更低 是 發(fā)酵 生產(chǎn)更為理想的方式 總體而言 篩選高產(chǎn)的藤 倉赤霉菌和優(yōu)化發(fā)酵條件 是提高 生產(chǎn)效 率 降低生產(chǎn)成本的有效途徑 鑒于此 該研究對 引進(jìn)的 株產(chǎn) 菌株的生長特性 發(fā)酵效率 進(jìn)行比較分析 篩選出優(yōu)良菌株 同時對優(yōu)良菌株 固態(tài)發(fā)酵體系進(jìn)行了初步探索 以期為實現(xiàn) 高效發(fā)酵生產(chǎn)奠定基礎(chǔ) 材料與方法 試驗材料 供試菌株為 株產(chǎn)赤霉素的藤倉赤霉菌 由寧夏泰瑞制藥股份有 限公司技術(shù)中心引進(jìn)保存 和制霉素購自 公司 其它試劑均為國產(chǎn)分析純 恒溫大幅振蕩搖床 武漢科學(xué)儀器 廠 恒溫培養(yǎng)箱 江蘇杰瑞爾電器有限公 司 高效液相色譜系統(tǒng) 活化斜面培養(yǎng) 基 馬鈴薯粉 葡萄糖 蒸 餾 水 瓊 脂 自 然 種 子 培 養(yǎng) 基 馬 鈴 薯 粉 葡 萄 糖 蒸餾水 脂肪 酶篩選培養(yǎng)基 馬鈴薯粉 葡萄糖 豆油 瓊脂 制霉素抗性篩選 培 養(yǎng) 基 馬 鈴 薯 粉 葡 萄 糖 蒸餾水 瓊脂 滅菌冷卻后添加 制霉素 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基 三角 瓶 號培養(yǎng)基為麩皮 玉米淀粉 玉米粉 玉米 芯 豆油 蒸餾水 號培養(yǎng)基為麩皮 玉 米淀 粉 玉 米 粉 玉 米 秸 稈 豆 油 蒸 餾 水 號培養(yǎng)基為麩皮 玉米粉 棉籽殼 玉米秸 稈 豆油 蒸餾水 試驗方法 菌種活化 將菌種從 保藏室取出 恢復(fù)至室溫 用接種 環(huán)分別挑取菌絲 接種于活化平板上 培養(yǎng) 保存待用 細(xì)胞懸液制備 將培養(yǎng)好的菌絲無菌過濾后 分別置于裝有 無菌水的三角瓶 規(guī)格 瓶底有鋼 珠 粒 中 搖床振蕩 培養(yǎng) 破碎菌絲 用蒸餾水稀釋 倍 制 成細(xì)胞懸液備用 脂肪酶活性篩選 參照李祖義等 的方法 并做適當(dāng)改進(jìn) 吸 取不同菌株的細(xì)胞懸液 分別涂布在脂肪酶篩選 培養(yǎng)基上 培養(yǎng) 比較不同菌株培養(yǎng)基 觀察變色圈 每個菌株涂布 皿 重復(fù) 次 制霉素抗性篩選 吸 取 不 同 菌 株 的 細(xì) 胞 懸 液 分 別 涂 布 含 制霉素于抗性培養(yǎng)基上 培 養(yǎng) 比較不同菌株的生長情況 每個菌株涂布 皿 重復(fù) 次 種子制備 刮取斜 面 菌 絲 將 菌 絲 過 濾 后 置 于 裝 有 無菌水的三角瓶 規(guī)格 瓶底有鋼 珠 粒 中 搖床振蕩 培養(yǎng) 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基種類和發(fā)酵時間的篩選 以 接種量 將種子液分別接種到 裝 有 不 同 種 類 固 態(tài) 培 養(yǎng) 基 的 三 角 瓶 中 發(fā)酵培養(yǎng) 后 每隔 取樣 次 測定樣品中赤霉素的含量 每個菌株接種 瓶 重復(fù) 次 赤霉素含量測定 參照馮耀基等 的方法 并做適當(dāng)改進(jìn) 稱 取烘干后的固體發(fā)酵料 于研缽中研碎 將粉 末置 于 燒 杯 中 加 入 甲 醇 溶 液 超聲 布氏漏斗抽濾 濾渣按 上述操作重新提取 次 然后將所得的濾液合 并 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在 條件下減壓濃縮至 液相條件 柱 流動相 為乙腈 水 流速為 柱 溫為室溫 以測得的 含量與固體發(fā)酵料的 比值作為固體發(fā)酵效價 并以此評價發(fā)酵效果 數(shù)據(jù)分析 采用 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和作圖 結(jié)果與分析 菌株脂肪酶活性分析 株菌株經(jīng)活化及細(xì)胞懸液制備后 分別涂 布脂肪酶活性篩選平板 對菌株變色圈進(jìn)行比較 分析 其 脂 肪 酶 活 性 由 表 可 知 編 號 和 的 株菌株具有較明顯的水解帶 表明其具有較 高的脂肪酶活性 且這 株菌株的菌落直徑較 大 表明其生長速率較快 可作為出發(fā)菌株 菌株制霉素抗性分析 將上述 株菌株的細(xì)胞懸液分別涂布制霉 素 抗 性 平 板 對 其 進(jìn) 行 分 析 發(fā) 現(xiàn) 編 號 和 的 株菌株在抗性培養(yǎng)基上形成的 菌落數(shù)較多 個 皿 且菌 落 直 徑 較 大 北 方 園 藝 月 上 表明其具有較強(qiáng)的制霉素抗性 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基種類和發(fā)酵時間的篩選 以 和 為發(fā)酵生產(chǎn)菌株 進(jìn) 表 菌株脂肪酶活性分析 菌株編號 水解帶明顯程度 菌落直徑 注 表示菌落邊緣水解圈十分明顯 表示菌落邊緣水解圈 明顯 表示菌落邊緣水解圈不明顯 表 菌株制霉素抗性分析 菌株編號 菌落數(shù) 個 皿 菌落直徑 普通培養(yǎng)基 抗性培養(yǎng)基 普通培養(yǎng)基 抗性培養(yǎng)基 注 表示菌株在培養(yǎng)基上未形成明顯菌落 抗性培養(yǎng)基上的菌落 直徑大于 的菌株視為制霉素抗性較強(qiáng)的菌株 行發(fā)酵試驗 對培養(yǎng)基種類和發(fā)酵時間進(jìn)行篩選 由圖 可知 在 種培養(yǎng)基中 號培養(yǎng) 基 隨著發(fā)酵時間的延長 這 株菌株的發(fā)酵效 價均呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢 當(dāng)發(fā)酵時間達(dá)到 效價趨于穩(wěn)定 升高不明顯 在 號培養(yǎng)基中發(fā)酵 菌株 效價分別達(dá)到 和 較 和 明顯要高 在 號培 養(yǎng) 基 中 發(fā) 酵 菌 株 效價較 號培養(yǎng)基有 所 降 低 分 別 為 和 在 號培養(yǎng)基中 發(fā)酵 菌株 效價 較 號培養(yǎng)基也有所降低 分別為 和 結(jié)果表明 菌株 具有較高發(fā)酵效價 且在 種不同 培養(yǎng)基中顯示出較好的適應(yīng)性 圖 不同菌株在 號培養(yǎng)基中 不同發(fā)酵時間的發(fā)酵效價 圖 不同菌株在 號培養(yǎng)基中 不同發(fā)酵時間的發(fā)酵效價 第 期 北 方 園 藝 圖 不同菌株在 號培養(yǎng)基中 不同發(fā)酵時間的發(fā)酵效價 菌株遺傳穩(wěn)定性分析 將 分別進(jìn)行傳代 培養(yǎng) 傳代 次 以 號培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基 對 每代菌株的發(fā)酵效價進(jìn)行分析 由圖 可知 發(fā)酵 后 菌株 各 代的效價均在 無明顯變化 結(jié)果表明 發(fā)酵效價具 有較好的遺傳穩(wěn)定性 圖 菌株發(fā)酵效價遺傳穩(wěn)定性分析 圖 菌株發(fā)酵效價遺傳穩(wěn)定性分析 討論與結(jié)論 作為一種植物激素 具有多種十分重要 的生物學(xué)作用 在農(nóng)業(yè) 林業(yè) 釀造 畜牧業(yè)等方面 應(yīng)用廣泛 目前 在國內(nèi)主要依靠液體深 層發(fā)酵方式進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn) 發(fā)酵效價長期處在 左右 導(dǎo)致生產(chǎn)成本一直偏高 嚴(yán)重阻礙 了 擴(kuò)大生產(chǎn)和進(jìn)一步的推廣應(yīng)用 菌株 的效價是發(fā)酵生產(chǎn)的保障 高產(chǎn)菌株的選育是提 高 生產(chǎn)效率的根本途徑 學(xué)者們通過誘變手 段篩選效價提高的突變菌株 而科學(xué)合理的指標(biāo) 是對這些菌株開展篩選的關(guān)鍵 生產(chǎn)的發(fā) 酵菌株主要包括藤倉赤霉菌 和串珠鐮刀菌 其 中藤倉赤霉菌應(yīng)用較為成熟 大量研究表明 脂 肪酶活性和制霉素抗性是 高產(chǎn)藤倉赤霉菌 菌株定向篩選的重要指標(biāo) 為此 該研究 首先以脂肪酶活性 制霉素抗性作為指標(biāo) 對引進(jìn) 的 株產(chǎn) 藤倉赤霉菌菌株進(jìn)行了比較篩 選 篩選出具有較高脂肪酶活性和制霉素抗性的 候選菌株 該選擇篩選方法與王衛(wèi)等 廖海兵 等 相一致 發(fā)酵方式及條件的優(yōu)化是提高 生產(chǎn)效 率的有效方法 當(dāng)前 液體發(fā)酵法存在諸多局限 比較而言 固態(tài)發(fā)酵法較液態(tài)法具有明顯優(yōu)勢 是 未來 發(fā)酵生產(chǎn)的理想方式 但國內(nèi)鮮見應(yīng)用 生產(chǎn)的報道 為此 在完成菌株初篩的基礎(chǔ) 上 該研究對初篩菌株適宜固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā) 酵時間進(jìn)行了初步探索 發(fā)現(xiàn) 菌株在組分為麩皮 玉米淀粉 玉米粉 玉米芯 豆油 蒸餾水的培養(yǎng)基中 發(fā)酵 效 價分別達(dá)到 和 這與 等 的研究報道相當(dāng) 之后 發(fā) 酵效價 增 長 并 不 明 顯 這 與 劉 鳳 莉 等 王 衛(wèi) 等 的研究結(jié)果類似 比較而言 在組分為麩 皮 玉米淀粉 玉米粉 玉米秸稈 豆油 蒸餾水的 培養(yǎng)基和組分為麩皮 玉米粉 棉籽殼 玉米秸稈 豆 油 蒸 餾 水 的 培 養(yǎng) 基 中 菌 株 發(fā) 酵 效 價 均 有 所 降 低 但 是 這 種培養(yǎng)基中添加了玉米秸稈 棉籽殼等低價值 的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)殘余物 對降低 發(fā)酵生產(chǎn)成本具 有重要意義 有關(guān) 菌 北 方 園 藝 月 上 株中試生產(chǎn)試驗正在進(jìn)行之中 菌株的優(yōu)良特性 和生產(chǎn)效率在規(guī)?；a(chǎn)中的實際表現(xiàn)還有待進(jìn) 一步驗證 參考文獻(xiàn) 母洪娜 楊秀蓮 王良桂 赤霉素在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用研 究進(jìn)展 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 彭輝 施天穹 聶志奎 等 微生物發(fā)酵產(chǎn)赤霉素的研究進(jìn)展 化工進(jìn)展 江瀾 馬有勝 邱昭輝 赤霉素的固態(tài)分批補(bǔ)料發(fā)酵與傳統(tǒng) 的液態(tài)發(fā)酵比較試驗 渝州大學(xué)學(xué)報 武文竹 陳俊英 白凈 等 赤霉素高產(chǎn)菌株選育及其固態(tài)發(fā) 酵研究進(jìn)展 河南農(nóng)業(yè)科學(xué) 余卿 覃紅 汪育同 等 赤霉素產(chǎn)生菌 菌株原生質(zhì)體 的形成再生和紫外光對原生質(zhì)體誘變條件的研究 微生物學(xué) 雜志 李武軍 鄭幼霞 赤霉素生產(chǎn)菌 藤倉赤霉菌融合重組的研 究 微生物學(xué)報 張金兒 朱江萍 劉義雄 等 從氯霉素抗性突變株篩選赤霉 素高產(chǎn)菌株 中國抗生素雜志 王衛(wèi) 李忠海 黎繼烈 等 以脂肪酶為指標(biāo)篩選赤霉素高產(chǎn) 菌株的研究 工業(yè)微生物 李祖義 朱明華 馮青 等 胞外脂酶活力的檢測法 微生 物學(xué)通報 馮耀基 黎少映 蘭紅軍 等 高效液相色譜法測定蔬菜中的 赤霉素 和 微量元素與健 康 研 究 王衛(wèi) 郭珺 曾柏全 等 利用制霉菌素抗性篩選赤霉素高產(chǎn) 菌株的研究 北方園藝 廖海兵 雷文 徐永華 利用制霉菌素抗性篩選赤霉素高產(chǎn) 菌株 農(nóng)業(yè)科學(xué) 劉風(fēng)莉 白凈 李攀 等 赤霉素固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的研究 廣東化工 王衛(wèi) 黎繼烈 黃衛(wèi)文 等 利用特比萘芬抗性篩選赤霉素高 產(chǎn)菌株及相關(guān)發(fā)酵特性的研究 微生物學(xué)通報 第 期 北 方 園 藝